La stimulation mécanique contrôle la fonction des ostéoclastes par la régulation du Ca2+

Oct 27, 2023

Communications Biology volume 6, Article number: 407 (2023) Citer cet article

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Le chargement de force mécanique est essentiel pour maintenir l'homéostasie osseuse, et l'exposition au déchargement peut entraîner une perte osseuse. Les ostéoclastes sont les seules cellules de résorption osseuse et jouent un rôle crucial dans le remodelage osseux. Les mécanismes moléculaires sous-jacents aux changements induits par la stimulation mécanique dans la fonction des ostéoclastes restent à élucider. Nos recherches précédentes ont révélé que le canal Cl− activé par Ca2+ Anoctamin 1 (Ano1) était un régulateur essentiel de la fonction des ostéoclastes. Ici, nous rapportons que Ano1 médie les réponses des ostéoclastes à la stimulation mécanique. In vitro, les activités des ostéoclastes sont évidemment affectées par le stress mécanique, qui s'accompagne de modifications des niveaux d'Ano1, de la concentration intracellulaire de Cl− et de la signalisation en aval du Ca2+. Ano1 knock-out ou les mutants de liaison au calcium atténuent la réponse des ostéoclastes à la stimulation mécanique. In vivo, Ano1 knock-out dans les ostéoclastes émousse le chargement induit l'inhibition des ostéoclastes et le déchargement induit la perte osseuse et. Ces résultats démontrent que Ano1 joue un rôle important dans les changements d'activité des ostéoclastes induits par la stimulation mécanique.

Le remodelage osseux dépend fortement de la stimulation mécanique, comme en témoignent l'augmentation de la masse osseuse chez les athlètes et la perte osseuse dramatique dans des conditions d'alitement prolongé1 ou de microgravité pendant les vols spatiaux2. Le stress mécanique améliore la masse osseuse principalement en augmentant le nombre d'ostéoblastes, en favorisant son activité et en régulant à la hausse son recrutement, stimulant ainsi la formation osseuse3,4. À l'inverse, l'absence de stimulation mécanique réduit la masse osseuse en inhibant la formation osseuse5 et en favorisant l'ostéoclastogenèse et la résorption osseuse consécutive6. Traditionnellement, les ostéoblastes et les ostéocytes étaient considérés comme les cellules responsables de la détection des stimuli mécaniques, et leurs rôles dans le métabolisme osseux ont été largement documentés7,8. Néanmoins, les effets des stimuli mécaniques sur les ostéoclastes ont été à peine signalés et le mécanisme de réponse des ostéoclastes au stress mécanique reste à comprendre. Pour utiliser efficacement les signaux mécaniques en clinique comme intervention non médicamenteuse pour l'ostéoporose, il est essentiel d'identifier les composants du défi mécanique qui sont critiques pour le remodelage osseux.

Les stimuli mécaniques représentent des signaux environnementaux importants que les organismes vivants doivent détecter et gérer5,9. La détection de la force mécanique est conservée dans tous les domaines de la vie, avec une variété de protéines impliquées dans la détection et la réponse aux forces mécaniques10,11,12. Parmi eux, les canaux ioniques mécanosensibles sont activés directement par les forces mécaniques appliquées aux cellules13,14. Les cellules convertissent les stimuli mécaniques en signaux électriques ou chimiques via ces canaux ioniques mécanosensibles, qui s'ouvrent et se ferment en réponse aux stimuli mécaniques15,16. Notre découverte précédente a révélé que le canal Piezo1 mécanosensible dans les ostéoblastes est nécessaire à la formation osseuse, car il fonctionne comme un transducteur clé de la mécanosensibilité dans les ostéoblastes8. Cependant, les canaux ioniques mécanosensibles des ostéoclastes restent moins étudiés.

L'anoctamine-1 (ANO1), également connue sous le nom de TMEM16A, a été identifiée comme un canal chlorure activé par le calcium. ANO1 joue un rôle important dans une variété de cellules, y compris le contrôle de l'excitabilité des cellules musculaires lisses17,18 et des neurones19, la sécrétion de liquide par les cellules épithéliales20, la sensation de douleur aiguë21, la transduction olfactive22, la prolifération, la survie et la migration des cellules cancéreuses23,24. Notre étude précédente a montré qu'ANO1 est un régulateur essentiel de la fonction des ostéoclastes et que son activité de canal contribue à son interaction avec RANK, qui favorise les voies de signalisation en aval induites par RANKL25.

La structure du cryo-EM d'Ano1 révèle que chaque sous-unité comprend dix segments transmembranaires (TM), avec TM3–8 bordant un chemin conducteur d'ions. Des analyses bioinformatiques basées sur des stratégies d'identification de relations phylogénétiques distantes suggèrent qu'Ano1 est évolutivement lié aux canaux mécanosensibles OSCA (hyperosmolality-gated calcium-permeable channel)26. De plus, compte tenu des caractéristiques de la carte cryo-EM et des similitudes structurelles entre les canaux OSCA mécanosensibles et le canal ANO1, nous proposons que les protéines de la famille ANO possèdent les mêmes caractéristiques mécanosensibles que les canaux ioniques OSCA mécanosensibles.

Dans cette étude, nous avons constaté que la stimulation mécanique entraîne des modifications de la fonction des ostéoclastes et Ano1 joue un rôle essentiel dans ce processus. La stimulation mécanique induite par le stress de cisaillement des fluides (FSS) ou l'hypergravité (HG) a inhibé l'activité des ostéoclastes, ce qui s'est accompagné d'une diminution des niveaux d'Ano1. À l'inverse, le déchargement mécanique dans des conditions de microgravité simulées (MG) entraîne une augmentation des niveaux d'Ano1 et favorise par la suite l'activité des ostéoclastes. Le déficit en ANO1 en ostéoclastes réduit sa sensibilité à la stimulation mécanique. Mécaniquement, l'activité du canal ANO1 a été modifiée par la signalisation mécanique, entraînant des modifications de la concentration intracellulaire de Cl- et des voies médiées par le calcium. Le knock-out Ano1 dans les ostéoclastes inhibe de manière significative l'activation des ostéoclastes induite par la décharge et atténue la perte osseuse induite par la décharge. Ces résultats démontrent que Ano1 est un facteur intrinsèque qui permet aux ostéoclastes de répondre à une stimulation mécanique.

Pour examiner l'effet de la stimulation mécanique sur l'activité des ostéoclastes, nous avons utilisé les trois forces mécaniques suivantes, la contrainte de cisaillement des fluides (FSS), l'hypergravité (HG) et la microgravité simulée (MG), pour stimuler les ostéoclastes. Douze dyn / cm2 de traitement FSS et 4 g HG ont été utilisés pour étudier l'effet de la charge mécanique et le système de microgravité simulé a été utilisé pour étudier l'effet de la décharge mécanique sur la différenciation et les activités des ostéoclastes (Fig. 1a – c supplémentaires). Des macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris (BMM) ont été cultivés avec du M-CSF (10 ng/ml) seul pendant 1 jour, puis avec du M-CSF (30 ng/ml) et du RANKL (50 ng/ml) pendant 1 jour, 3 jours et 5 jours. Les cellules ont été traitées avec FSS, HG et MG dans l'ensemble du processus. Nous avons examiné l'expression des gènes marqueurs de chaque étape au cours de la différenciation des ostéoclastes27,28,29. Lorsque les cellules ont été traitées avec du FSS le jour 1, il n'y a eu aucun changement dans l'expression de la sous-unité d'intégrine alpha X (Itgax) et Cd74, gènes marqueurs du stade précoce de la différenciation des ostéoclastes (Fig. 2a supplémentaire). Au jour 3, l'expression des dendrocytes exprimant sept protéines transmembranaires (Dcstamp) et la sous-unité d2 de V0 transportant l'ATPase H + (Atp6v0d2), gènes marqueurs des préostéoclastes, a été supprimée (Fig. 2b supplémentaire). Au jour 5, l'expression du facteur nucléaire de la cellule T activée 1 (NFATc1), de la phosphatase acide 5 (Acp5), de la cathepsine K (Ctsk) et de la métalloprotéine matricielle 9 (Mmp9), gènes marqueurs de l'activité des ostéoclastes, a été significativement diminuée (Fig. 2c supplémentaire). Le niveau de protéine de NFATc1 a augmenté au cours de la différenciation des ostéoclastes et le FSS a inhibé le niveau de protéine NFATc1 (Fig. 1a). Le nombre de cellules TRAP + était plus faible chez les ostéoclastes traités par FSS que chez les ostéoclastes témoins (Fig. 1b). Des résultats similaires ont été observés chez les ostéoclastes après un traitement avec HG, qui n'a pas affecté l'expression d'Itgax et de Cd74, a régulé à la baisse l'expression de Dcstamp, Atp6v0d2, NFATc1, Acp5, Ctsk et Mmp9, a inhibé le niveau de protéine NFATc1 et a diminué le nombre de cellules TRAP + (Supplémentaire Fig. 2d – f, Fig. 1c, d). La microgravité a évidemment amélioré la différenciation et les activités des ostéoclastes, l'expression des gènes au stade précoce de la différenciation des ostéoclastes est restée inchangée (Fig. 2g supplémentaire), tandis que celle des gènes préostéoclastes et ostéoclastes était significativement plus élevée sous traitement avec MG que celle dans les cellules témoins (Fig. 2h, i supplémentaires). Le niveau de protéine de NFATc1 et le nombre de cellules TRAP + étaient significativement plus élevés chez les ostéoclastes traités à la MG que chez les ostéoclastes témoins (Fig. 1e, f).

une analyse Western blot du niveau de protéine NFATc1 pendant la différenciation des ostéoclastes sous un traitement par contrainte de cisaillement fluide (FSS) pendant 1 jour, 3 jours ou 5 jours. b Images représentatives de la coloration TRAP pendant la différenciation des ostéoclastes sous traitement FSS pendant 1 jour, 3 jours ou 5 jours (à gauche). Barre d'échelle, 200 μm. Quantification du nombre de cellules multinucléées par cm2 (à droite). (n = 0–231, à partir de trois expériences indépendantes). c Analyse Western blot du niveau de protéine NFATc1 pendant la différenciation des ostéoclastes sous traitement en hypergravité (HG) pendant 1 jour, 3 jours ou 5 jours. d Images représentatives de la coloration TRAP pendant la différenciation des ostéoclastes sous traitement HG pendant 1 jour, 3 jours ou 5 jours (à gauche). Barre d'échelle, 200 μm. Quantification du nombre de cellules multinucléées par cm2 (à droite). (n = 0–291, à partir de trois expériences indépendantes). e Analyse Western blot du niveau de protéine NFATc1 pendant la différenciation des ostéoclastes sous traitement en microgravité (MG) pendant 1 jour, 3 jours ou 5 jours. f Images représentatives de la coloration TRAP pendant la différenciation des ostéoclastes sous traitement MG pendant 1 jour, 3 jours ou 5 jours (à gauche). Barre d'échelle, 200 μm. Quantification du nombre de cellules multinucléées par cm2 (à droite). (n = 0–377, à partir de trois expériences indépendantes). g Analyse QRT-PCR du niveau d'ARNm Ano1 pendant la différenciation des ostéoclastes sous traitement FSS pendant 1 jour, 3 jours ou 5 jours. (n = 3 expériences indépendantes). h Analyse Western blot du niveau de protéine Ano1 pendant la différenciation des ostéoclastes sous traitement FSS pendant 1 jour, 3 jours ou 5 jours. i Analyse QRT-PCR du niveau d'ARNm Ano1 lors de la différenciation des ostéoclastes sous traitement HG pendant 1 jour, 3 jours ou 5 jours. (n = 3 expériences indépendantes). j Analyse Western blot du niveau de protéine Ano1 lors de la différenciation des ostéoclastes sous traitement HG pendant 1 jour, 3 jours ou 5 jours. k Analyse QRT-PCR du niveau d'ARNm Ano1 lors de la différenciation des ostéoclastes sous traitement MG pendant 1 jour, 3 jours ou 5 jours. (n = 3 expériences indépendantes). l Analyse Western blot du niveau de protéine Ano1 au cours de la différenciation des ostéoclastes sous traitement MG pendant 1 jour, 3 jours ou 5 jours. Toutes les données sont la moyenne ± sem Une analyse statistique avec plus de deux groupes a été réalisée avec une analyse de variance à deux facteurs (ANOVA) avec un test post-hoc de Šídák pour déterminer les différences entre les groupes. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Ces résultats suggèrent que la force mécanique affecte l'activité des ostéoclastes. Notre étude précédente a révélé que Ano1 joue un rôle essentiel dans l'activité des ostéoclastes. Les caractéristiques de la carte cryo-EM d'Ano1 et la similitude structurelle d'Ano1 avec l'OSCA mécanosensible nous ont incités à tester si Ano1 était impliqué dans la réponse des ostéoclastes à la stimulation mécanique. Sous traitement FSS ou HG, les niveaux d'Ano1 dans les ostéoclastes ont été significativement diminués (Fig. 1g – j). Lorsqu'ils étaient soumis à un traitement MG, les niveaux d'Ano1 étaient significativement augmentés dans les ostéoclastes (Fig. 1k, l). Ces résultats suggèrent que Ano1 est associé aux modifications des activités des ostéoclastes induites par la stimulation mécanique.

Pour déterminer si Ano1 médiait le rôle d'inhibition de la charge mécanique dans les ostéoclastes, nous avons isolé des ostéoclastes de souris knock-out Ano1 conditionnelles spécifiques aux ostéoclastes (Ctsk-Cre;Ano1fl/fl). Les résultats ont montré que les activités des ostéoclastes Ctsk-Cre;Ano1fl / fl étaient significativement inférieures à celles des ostéoclastes Ano1fl / fl (Fig. 2a – e). Nous avons soumis les ostéoclastes Ano1fl/fl et Ctsk-Cre;Ano1fl/fl à FSS pendant 30 min par jour pendant 2 jours et HG pendant 2 jours, respectivement. Le niveau d'ARNm d'Ano1 a diminué de 34, 53% et le niveau de protéines d'Ano1 a diminué de 47, 8% après le traitement FSS chez les ostéoclastes Ano1fl / fl, mais aucun changement significatif dans les ostéoclastes Ctsk-Cre;Ano1fl / fl (Fig. 2a, b). Le traitement FSS a entraîné une réduction de 40, 7% du nombre de cellules multinucléées TRAP + et une diminution significative de l'expression de NFATc1, Acp5, Ctsk et Mmp9 dans les ostéoclastes Ano1fl / fl (Fig. 2c – e). Il est connu que les résidus d'acides aminés conservés E702 et E705 sont deux sites clés pour l'activation des canaux Ca2+-dépendants, qui sont importants pour l'activité Ano1. Pour déterminer si le site de liaison au calcium joue un rôle clé dans la stimulation mécanique médiée par Ano1, les ostéoclastes Ctsk-Cre;Ano1fl/fl ont été transfectés avec le vecteur Ano1 de type sauvage (Ano1) ou le mutant Ano1 (E702/E705Q), puis traités avec du FSS. Nous avons constaté que les ostéoclastes Ctsk-Cre; Ano1fl / fl ne répondaient pas au FSS, Ano1 de type sauvage peut sauver la réponse des ostéoclastes Ctsk-Cre; Ano1fl / fl au FSS, mais pas Ano1 avec des mutants de sites de liaison Ca2 + (Fig. 2f). De même, le traitement à l'HG a entraîné une diminution à la fois des niveaux d'ARNm et de protéines Ano1 (Fig. 3a, b) et une réduction de 22, 5% du nombre d'ostéoclastes dans les ostéoclastes Ano1fl / fl, mais pas dans les ostéoclastes Ctsk-Cre; Ano1fl / fl (Fig. 3c, d). En conséquence, les expressions de NFATc1, Acp5, Ctsk et Mmp9 étaient également inhibées dans les ostéoclastes Ano1fl/fl, mais pas dans les ostéoclastes Ctsk-Cre;Ano1fl/fl (Fig. 3e). Les ostéoclastes Ctsk-Cre; Ano1fl / fl n'ont pas non plus répondu à HG, Ano1 de type sauvage peut sauver la réponse des ostéoclastes Ctsk-Cre; Ano1fl / fl à HG, mais pas Ano1 avec des mutants de sites de liaison Ca2 + (Fig. 3f). Ces données suggèrent que la charge mécanique médiée par Ano1 a induit la réduction de l'activité des ostéoclastes.

une analyse QRT-PCR du niveau d'ARNm Ano1 dans les ostéoclastes Ano1fl/fl et Ctsk-Cre;Ano1fl/fl après traitement avec Ctrl ou FSS (12 dyn/cm2, 30 min/jour) pendant 2 jours. (n = 3 expériences indépendantes). b Analyse par Western blot du niveau de protéine Ano1 dans les ostéoclastes Ano1fl/fl et Ctsk-Cre;Ano1fl/fl après traitement avec Ctrl ou FSS (à gauche). La quantification du niveau de protéine Ano1 dans les ostéoclastes (à droite). (n = 3 expériences indépendantes). c Images représentatives de la coloration TRAP dans les ostéoclastes Ano1fl/fl et Ctsk-Cre;Ano1fl/fl après traitement avec Ctrl ou FSS (12 dyn/cm2, 30 min/jour) pendant 2 jours. Barre d'échelle, 200 μm. d Quantification du nombre de cellules multinucléées par cm2. (n = 89–231, à partir de trois expériences indépendantes). e Analyse QRT-PCR des niveaux d'ARNm de NFATc1, Acp5, Ctsk et Mmp9 dans les ostéoclastes Ano1fl/fl et Ctsk-Cre;Ano1fl/fl après traitement avec Ctrl ou FSS pendant 2 jours. (n = 3 expériences indépendantes). f Analyse QRT-PCR des niveaux d'ARNm de NFATc1, Acp5, Ctsk et Mmp9 dans des ostéoclastes isolés de souris Ctsk-Cre;Ano1fl/fl. Les ostéoclastes ont été transfectés avec NC, WT Ano1 ou mutant Ano1 (E702/705Q) et traités avec ou sans FSS pendant 2 jours. (n = 3 expériences indépendantes) *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

une analyse QRT-PCR du niveau d'ARNm Ano1 dans les ostéoclastes Ano1fl/fl et Ctsk-Cre;Ano1fl/fl après traitement avec Ctrl ou HG (4 g) pendant 2 jours. (n = 3 expériences indépendantes). b Analyse Western blot du niveau de protéine Ano1 dans les ostéoclastes Ano1fl/fl et Ctsk-Cre;Ano1fl/fl après traitement avec Ctrl ou HG (à gauche). La quantification du niveau de protéine Ano1 dans les ostéoclastes (à droite). (n = 3 expériences indépendantes). c Images représentatives de la coloration TRAP dans les ostéoclastes Ano1fl/fl et Ctsk-Cre;Ano1fl/fl après traitement avec Ctrl ou HG (4 g) pendant 2 jours. Barre d'échelle, 200 μm. d Quantification du nombre de cellules multinucléées par cm2. (n = 109–312, à partir de trois expériences indépendantes). e Analyse QRT-PCR des niveaux d'ARNm de NFATc1, Acp5, Ctsk et Mmp9 dans les ostéoclastes Ano1fl/fl et Ctsk-Cre;Ano1fl/fl après traitement avec Ctrl ou HG. (n = 3 expériences indépendantes). f Analyse QRT-PCR des niveaux d'ARNm de NFATc1, Acp5, Ctsk et Mmp9 dans des ostéoclastes isolés de souris Ctsk-Cre;Ano1fl/fl. Les ostéoclastes ont été transfectés avec NC, WT Ano1 ou mutant Ano1 (E702/705Q) et traités avec ou sans HG pendant 2 jours. (n = 3 expériences indépendantes) *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Pour déterminer si Ano1 dans les ostéoclastes est impliqué dans la réponse au chargement mécanique in vivo, nous avons chargé le tibia gauche de souris femelles Ctsk-Cre;Ano1fl/fl et de souris Ano1fl/fl âgées de 16 semaines avec une déformation maximale de +1200 μɛ au milieu de la tige30. La coloration TRAP a montré que la charge mécanique pendant 2 semaines réduisait Oc.S/BS et N.Oc/B.Pm du tibia chez les souris Ano1fl/fl mais pas chez les souris Ctsk-Cre;Ano1fl/fl (Fig. 3a, b supplémentaires). Souris 1fl / fl (Fig. 3c, d supplémentaires). Ces résultats suggèrent que Ano1 dans les ostéoclastes joue un rôle important dans la réponse de l'os au chargement mécanique.

Pour déterminer si Ano1 a médié la réponse des ostéoclastes au déchargement mécanique, les ostéoclastes des souris Ano1fl/fl et Ctsk-Cre;Ano1fl/fl ont été soumis à un traitement de déchargement. Après traitement avec MG pendant 2 jours, les niveaux d'ARNm et de protéines d'Ano1 ont été significativement augmentés de 2, 7 fois et 2 fois dans les ostéoclastes Ano1fl / fl, respectivement, mais pas dans les ostéoclastes Ctsk-Cre; Ano1fl / fl (Fig. 4a, b). Le traitement à la MG a multiplié par deux le nombre de cellules multinucléées TRAP + et a augmenté de manière significative l'expression des gènes marqueurs des ostéoclastes dans les ostéoclastes Ano1fl / fl, mais pas dans les ostéoclastes Ctsk-Cre; Ano1fl / fl (Fig. 4c – e). De même, Ano1 de type sauvage peut sauver la réponse des ostéoclastes Ctsk-Cre; Ano1fl / fl à la MG, mais pas Ano1 avec des mutants de sites de liaison Ca2 + (Fig. 4f). Ces données suggèrent que l'inactivation d'Ano1 dans les ostéoclastes élimine la décharge mécanique induite par l'amélioration de l'activité des ostéoclastes.

une analyse QRT-PCR du niveau d'ARNm Ano1 dans les ostéoclastes Ano1fl/fl et Ctsk-Cre;Ano1fl/fl après traitement avec Ctrl ou MG pendant 2 jours. (n = 3 expériences indépendantes). b Analyse Western blot du niveau de protéine Ano1 dans les ostéoclastes Ano1fl/fl et Ctsk-Cre;Ano1fl/fl après traitement avec Ctrl ou MG pendant 2 jours (à gauche). La quantification du niveau de protéine Ano1 dans les ostéoclastes (à droite). (n = 3 expériences indépendantes). c Images représentatives de la coloration TRAP dans les ostéoclastes Ano1fl/fl et Ctsk-Cre;Ano1fl/fl après traitement avec Ctrl ou MG pendant 2 jours. Barre d'échelle, 200 μm. d Quantification du nombre de cellules multinucléées par cm2. (n = 130–453, à partir de six expériences indépendantes). e Analyse QRT-PCR des niveaux d'ARNm de NFATc1, Acp5, Ctsk et Mmp9 dans les ostéoclastes Ano1fl/fl et Ctsk-Cre;Ano1fl/fl après traitement avec Ctrl ou MG. (n = 3 expériences indépendantes). f Analyse QRT-PCR des niveaux d'ARNm de NFATc1, Acp5, Ctsk et Mmp9 dans des ostéoclastes isolés de souris Ctsk-Cre;Ano1fl/fl. Les ostéoclastes ont été transfectés avec NC, WT Ano1 ou mutant Ano1 (E702/705Q) et traités avec ou sans MG pendant 2 jours. (n = 3 expériences indépendantes). Toutes les données sont la moyenne ± sem Une analyse statistique avec plus de deux groupes a été réalisée avec une analyse de variance à deux facteurs (ANOVA) avec un test post-hoc de Šídák pour déterminer les différences entre les groupes. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Sur la base des caractéristiques d'Ano1 en tant que canal chlorure, nous étudions les changements du niveau de Cl− cytoplasmique dans les ostéoclastes en réponse à une stimulation mécanique. Nous avons utilisé un capteur de Cl− (la sonde fluorescente, MQAE), l'intensité de fluorescence de ce capteur est inversement proportionnelle à la concentration de Cl− intracellulaire, et une diminution de l'intensité de fluorescence est corrélée à une augmentation du niveau de Cl− cytoplasmique31. Curieusement, lorsqu'il était soumis au traitement FSS et HG, l'intensité de fluorescence du capteur Cl− était significativement réduite de 46,5 % et 42,4 % par une augmentation de la concentration intracellulaire de Cl− dans les ostéoclastes Ano1fl/fl, mais pas dans les ostéoclastes Ctsk-Cre;Ano1fl/fl (Fig. 5a, b). Cependant, lorsqu'il était soumis au traitement MG, l'intensité de fluorescence du capteur Cl− était augmentée, mais pas dans les ostéoclastes Ctsk-Cre;Ano1fl/fl (Fig. 5c). Ces résultats ont indiqué que la charge mécanique pouvait augmenter les niveaux de Cl- intracellulaires et que la décharge diminuait les niveaux de Cl- intracellulaires dans les ostéoclastes, ce qui était médié par Ano1.

Mesure de la concentration intracellulaire de chlorure dans les ostéoclastes. Toutes les cellules ont été colorées avec du MQAE 5 mM. a Images fluorescentes représentatives des ostéoclastes Ano1fl/fl et Ctsk-Cre;Ano1fl/fl après traitement avec Ctrl ou FSS (12 dyn/cm2, 30 min/jour) pendant 2 jours (à gauche). Barre d'échelle, 100 μm. L'intensité de fluorescence relative des ostéoclastes (à droite). (n = 3 expériences indépendantes). b Images fluorescentes représentatives des ostéoclastes Ano1fl/fl et Ctsk-Cre;Ano1fl/fl après traitement avec Ctrl ou HG (4 g) pendant 2 jours (à gauche). Barre d'échelle, 100 μm. L'intensité de fluorescence relative des ostéoclastes (à droite). (n = 3 expériences indépendantes). c Images fluorescentes représentatives des ostéoclastes Ano1fl/fl et Ctsk-Cre;Ano1fl/fl après traitement avec Ctrl ou MG pendant 2 jours (à gauche). Barre d'échelle, 100 μm. L'intensité de fluorescence relative des ostéoclastes (à droite). (n = 3 expériences indépendantes). Toutes les données sont la moyenne ± sem Une analyse statistique avec plus de deux groupes a été réalisée avec une analyse de variance à deux facteurs (ANOVA) avec un test post-hoc de Šídák pour déterminer les différences entre les groupes. **p < 0,01, ***p < 0,001.

Notre étude précédente a révélé qu'Ano1 était nécessaire pour l'activation de CaMKIVCreb médiée par RANKL pendant l'ostéoclastogenèse. Pour déterminer si Ano1 médie la réponse des ostéoclastes à la stimulation mécanique via la voie de signalisation CaMKIV-Creb, nous avons testé l'effet de la charge et de la décharge mécaniques sur la phosphorylation de CaMKIV et Creb. Les résultats ont montré que la phosphorylation de CaMKIV et Creb était diminuée, ce qui s'accompagnait d'une régulation négative de NFATc1 dans les ostéoclastes Ano1fl / fl après traitement avec FSS ou HG, mais il n'y avait aucun changement dans les ostéoclastes Ctsk-Cre;Ano1fl / fl (Fig. 6a – h). La phosphorylation de CaMKIV et Creb, et les niveaux de protéines NFATc1 étaient tous augmentés dans les ostéoclastes Ano1fl / fl après traitement avec MG, mais il n'y avait aucun changement dans les ostéoclastes Ctsk-Cre;Ano1fl / fl entre Ctrl et MG groupe (Fig. 6i – l). Ces résultats indiquent que la signalisation CaMKIV-Creb-NFATc1 est impliquée dans la stimulation mécanique médiée par Ano1 sur l'activité des ostéoclastes.

une analyse Western blot des taux de protéines p-CaMKIV, CaMKIV, p-Creb, Creb et NFATc1 chez les ostéoclastes Ano1fl/fl et Ctsk-Cre;Ano1fl/fl avec traitement Ctrl ou FSS (12 dyn/cm2, 30 min/jour) pendant 2 jours. b–d La quantification des taux de protéines p-CaMKIV, p-Creb et NFATc1 chez les ostéoclastes. Le niveau de protéine p-CaMKIV a été normalisé sur CaMKIV, le niveau de protéine p-Creb a été normalisé sur Creb et le niveau de protéine NFATc1 a été normalisé sur Gapdh. (n = 3 expériences indépendantes). e Analyse Western blot des niveaux de protéines p-CaMKIV, CaMKIV, p-Creb, Creb et NFATc1 dans les ostéoclastes Ano1fl/fl et Ctsk-Cre;Ano1fl/fl avec traitement Ctrl ou HG (4 g) pendant 2 jours. f–h La quantification des taux de protéines p-CaMKIV, p-Creb et NFATc1 chez les ostéoclastes. Le niveau de protéine p-CaMKIV a été normalisé sur CaMKIV, le niveau de protéine p-Creb a été normalisé sur Creb et le niveau de protéine NFATc1 a été normalisé sur Gapdh. (n = 3 expériences indépendantes). i Analyse Western blot des taux de protéines p-CaMKIV, CaMKIV, p-Creb,Creb et NFATc1 chez les ostéoclastes Ano1fl/fl et Ctsk-Cre;Ano1fl/fl avec traitement Ctrl ou MG pendant 2 jours. j–l La quantification des taux de protéines p-CaMKIV, p-Creb et NFATc1 chez les ostéoclastes. Le niveau de protéine p-CaMKIV a été normalisé sur CaMKIV, le niveau de protéine p-Creb a été normalisé sur Creb et le niveau de protéine NFATc1 a été normalisé sur Gapdh. (n = 3 expériences indépendantes). Toutes les données sont la moyenne ± sem L'analyse statistique a été réalisée avec une analyse de variance à deux facteurs (ANOVA) avec un test post-hoc de Šídák pour déterminer les différences entre les groupes. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Pour déterminer si Ano1 intervient dans la perte osseuse induite par le déchargement mécanique, nous avons utilisé le modèle de suspension de la patte arrière (HS) pour examiner les modifications osseuses de la patte arrière en réponse à la décharge de mise en charge. Les souris Ano1fl/fl et Ctsk-Cre;Ano1fl/fl âgées de trois mois ont été soumises à HS pendant 28 jours. Les niveaux d'ARNm et de protéines d'Ano1 ont été significativement augmentés dans les tissus osseux de souris Ano1fl / fl soumises à HS (Fig. 7a, b). L'analyse micro-CT a montré que la masse osseuse trabéculaire et les paramètres liés à l'architecture, y compris le rapport du volume osseux au volume tissulaire (BV / TV), le nombre trabéculaire (Tb.N) et l'épaisseur trabéculaire (Tb.Th), étaient significativement réduits et l'espacement trabéculaire (Tb.Sp) a été augmenté en conséquence chez les souris Ano1fl / fl après traitement avec HS (Fig. 7c, d). Les souris Ctsk-Cre;Ano1fl/fl soumises à HS présentaient une masse osseuse trabéculaire, BV/TV, Tb.N et Tb.Th beaucoup plus élevées que celles des souris Ano1fl/fl soumises à HS. En conséquence, Tb.Sp était beaucoup plus faible chez les souris Ctsk-Cre;Ano1fl/fl que chez les souris témoins (Fig. 7c, d). Ensuite, nous avons analysé les changements correspondants dans la fonction des ostéoclastes après le traitement HS. La coloration TRAP a montré une activité manifestement accrue des ostéoclastes chez les souris Ano1fl/fl soumises à HS. Cependant, HS n'a induit qu'une faible augmentation de l'activité TRAP chez les souris Ctsk-Cre;Ano1fl/fl, qui était beaucoup plus faible que celle observée chez les souris Ano1fl/fl (Fig. 7e). La surface des ostéoclastes par surface osseuse (Oc.S/BS) et le nombre d'ostéoclastes par périmètre osseux (N.Oc/B.Pm) dans le tibia proximal des souris Ctsk-Cre;Ano1fl/fl soumises à HS étaient bien inférieurs à ceux des souris Ano1fl/fl (Fig. 7f). En conséquence, le niveau de CTX-1 a augmenté de manière significative dans le sérum des souris Ano1fl / fl, alors qu'il a légèrement augmenté chez les souris Ctsk-Cre; Ano1fl / fl (Fig. 7g). L'analyse QRT-PCR a montré que les niveaux d'ARNm de NFATc1, Acp5, Ctsk et Mmp9 étaient tous significativement réduits dans le tissu osseux des souris Ctsk-Cre;Ano1fl/fl soumises à HS par rapport aux souris témoins Ano1fl/fl soumises à HS (Fig. 7h). Pour vérifier le changement de la formation osseuse chez les souris Ctsk-Cre;Ano1fl/fl et les souris Ano1fl/fl après traitement HS, nous avons injecté de la calcéine par voie intrapéritonéale à des souris 10 jours et 2 jours avant l'euthanasie pour marquer la nouvelle formation osseuse. Après traitement avec HS, le taux d'apposition minérale (MAR) et le taux de formation osseuse par surface osseuse (BFR/BS) dans les tibias des souris Ano1fl/fl ont diminué de 31 % et 17 %, respectivement. Leurs niveaux dans les tibias des souris Ctsk-Cre; Ano1fl / fl après traitement HS ont diminué de 21% et 4% par rapport au groupe Ctrl, respectivement (Fig. 4a, b supplémentaires).

a, b Analyse QRT-PCR du niveau d'ARNm Ano1 et analyse Western blot du niveau de protéine Ano1 dans les tissus osseux de souris Ano1fl/fl et Ctsk-Cre;Ano1fl/fl avec traitement Ctrl ou suspension des membres postérieurs (HS). (n = 6 pour chaque groupe). c Images représentatives montrant l'architecture trabéculaire tridimensionnelle telle que déterminée par la reconstruction micro-CT des fémurs distaux des groupes de souris indiqués. Barre d'échelle, 0,5 mm. d Mesures micro-CT pour le volume osseux par volume tissulaire (BV/TV), le nombre trabéculaire (Tb.N), l'épaisseur trabéculaire (Tb.Th) et l'espacement trabéculaire (Tb.Sp) dans les fémurs distaux des groupes de souris indiqués. (n = 6 pour chaque groupe). e Images représentatives de la coloration TRAP du tibia proximal des groupes de souris indiqués. Barre d'échelle, 50 μm. f Analyse histomorphométrique des images pour le nombre d'ostéoclastes par périmètre osseux (N.Oc/B.Pm) et surface d'ostéoclastes par surface osseuse (Oc.S/BS). (n = 6 pour chaque groupe). g Analyse ELISA du taux de protéine CTX-1 dans le sérum des groupes de souris indiqués. (n = 6 pour chaque groupe). h Analyse QRT-PCR des niveaux d'ARNm de NFATc1, Acp5, Ctsk et Mmp9 dans les tissus osseux prélevés dans les groupes de souris indiqués. (n = 6 pour chaque groupe). Une analyse statistique avec plus de deux groupes a été réalisée avec une analyse de variance à deux facteurs (ANOVA) avec un test post-hoc de Šídák pour déterminer les différences entre les groupes. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Dans cette étude, nous démontrons qu'Ano1 est un canal mécanosensible précédemment non identifié chez les ostéoclastes. Nous avons constaté que la fonction des ostéoclastes est régulée par un traitement mécanique, qui s'accompagne de modifications des niveaux d'Ano1. Sous une contrainte de cisaillement du fluide de 12 dyn/cm2 ou des conditions d'hypergravité de 4 g, l'activité des ostéoclastes a été inhibée et l'expression de Ano1 a été diminuée. Inversement, la microgravité simulée favorise l'activité des ostéoclastes et augmente les niveaux d'Ano1. Ici, nous avons identifié les fonctions Ano1 comme un régulateur important des réponses des ostéoclastes au stress mécanique (Fig. 8). De plus, dans des conditions de charge mécanique, la concentration en ions chlorure intracellulaire a été augmentée et le signal de calcium a été inhibé. La décharge mécanique, en revanche, réduit la concentration intracellulaire en ions chlorure et favorise le signal calcique. Les niveaux intracellulaires de Cl− sont nécessaires au maintien de l'acidification extracellulaire. Ano1 knock-out ou les mutants de sites de liaison Ca2+ d'Ano1 dans les ostéoclastes n'ont pas répondu au chargement ou au déchargement mécanique. Ces résultats suggèrent que Ano1 fonctionne comme un capteur mécanique dans les ostéoclastes grâce à ses activités de canaux régulés par le calcium.

Ano1 fonctionne comme un capteur mécanique dans les ostéoclastes grâce à ses activités de canaux régulés par le calcium.

Au cours de la dernière décennie, les ostéoblastes et les ostéocytes étaient connus pour être le principal répondeur à la stimulation mécanique dans le tissu osseux. Le changement de la fonction des ostéoclastes sous différents stimuli mécaniques a été considéré comme étant largement attribué aux ostéoblastes et aux ostéocytes. La charge mécanique augmente la fonction des ostéoblastes et des ostéocytes8,32,33. L'ostéoclastogenèse et la fonction des ostéoclastes sont régulées par la sécrétion de RANKL par les ostéoblastes et les ostéocytes34,35. Cependant, dans les conditions de microgravité et de microgravité simulée, la fonction des ostéoblastes est supprimée, la masse osseuse et le contenu minéral sont réduits, les microstructures corticales et trabéculaires de l'os sont altérées32,36. Pourtant, la fonction des ostéoclastes augmente encore dans des conditions de décharge osseuse, à la fois sur Terre et dans l'espace. Cela soulève la question de savoir quels facteurs intrinsèques permettent aux ostéoclastes d'être sensibles aux stimuli mécaniques, indépendamment des modifications des ostéoblastes ou des ostéocytes. Les canaux ioniques sont des protéines multimères porogènes situées dans la membrane plasmique. Ils ont la capacité de s'ouvrir et de se fermer en réponse à différents signaux mécaniques37,38,39,40,41,42. Il existe des preuves que la différenciation des ostéoclastes peut être supprimée par le FSS par des changements morphologiques et des altérations de l'expression des gènes. Une précédente étude in vitro a montré qu'il existe deux types de canaux de transduction mécanique en réponse à la stimulation du FSS lors de la différenciation des ostéoclastes. Plus précisément, la molécule 1 d'interaction stromale de la protéine transmembranaire de type 1A (STIM1) médie l'oscillation [Ca2+]i induite par le FSS au cours du stade précoce de la différenciation des ostéoclastes, tandis que le membre de la famille du potentiel de récepteur transitoire (TRP) TRPV4 joue un rôle important dans le flux de Ca2+ induit par le FSS et l'oscillation [Ca2+]i au stade tardif de la différenciation des ostéoclastes43. Dans notre étude, nous avons constaté que la stimulation du FSS et de l'HG inhibe l'expression et l'activité du canal Ano1 en augmentant le [Cl−] i intracellulaire et en inhibant la voie en aval activant le Ca2+ dans les ostéoclastes. En revanche, la stimulation de la MG favorise l'expression d'Ano1 et l'activité du canal en réduisant le [Cl-]i intracellulaire et en activant la voie en aval activant le Ca2+.

Récemment, la structure cryo-EM d'Ano1 a été résolue, ce qui a révélé son homologie structurelle avec les canaux mécanosensibles tels que OSCA1.2 et d'autres membres de la famille OSCA41. Ils ont des architectures dimériques, des structures de domaines transmembranaires et des emplacements de pores similaires26. Ces résultats suggèrent un rôle potentiel de Ano1 dans la mécanosensation. Ici, nous avons constaté que la réponse des ostéoclastes à la stimulation mécanique est Ano1-dépendante. Les niveaux et l'activité d'Ano1 soulignent l'effet de la stimulation mécanique sur les ostéoclastes. De plus, l'expression d'Ano1 est modulée par différentes stimulations mécaniques. Le chargement mécanique diminue les niveaux Ano1, tandis que le déchargement mécanique augmente les niveaux Ano1. L'inactivation d'Ano1 dans les ostéoclastes atténue considérablement leur sensibilité à la stimulation mécanique. Cependant, pour déterminer Ano1 en tant que mécanocapteur, les changements d'architecture des canaux Ano1 sous stimulation mécanique doivent être davantage élucidés.

Pris ensemble, nos découvertes ont établi que les activités des ostéoclastes sont évidemment affectées par le stress mécanique, qui s'accompagne d'une altération des niveaux d'Ano1, de la concentration intracellulaire de Cl− et de la signalisation Ca2+. Les souris knock-out Ano1 spécifiques aux ostéoclastes sont résistantes à la perte osseuse induite par le déchargement en atténuant la réponse des ostéoclastes. Ces résultats démontrent que Ano1 est un facteur intrinsèque qui confère aux ostéoclastes la capacité de répondre à une stimulation mécanique. Les inhibiteurs spécifiques d'Ano1 constituent une approche prometteuse pour lutter contre la perte osseuse.

Les souris floxées Ano1 (Ano1fl/fl, un don généreux du Dr Min-Sheng Zhu)44 ont été croisées avec la souche Ctsk-Cre (un don généreux du Dr Weiguo Zou)45 pour générer des souris Ctsk-Cre;Ano1fl/fl. Toutes les souris analysées ont été maintenues sur le fond C57BL/6. Les animaux ont été élevés et maintenus dans des conditions spécifiques exemptes d'agents pathogènes (SPF) dans le bâtiment de recherche animale du centre de recherche et de formation des astronautes de Chine (cycles de lumière de 12 h, cycles d'obscurité de 12 h, température contrôlée à 21 ± 2 ° C avec libre accès à la nourriture et à l'eau). Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par les comités d'éthique animale et de sécurité expérimentale du Centre de recherche et de formation des astronautes chinois (numéro de référence : ACC-IACUC-2022-002).

Des macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris (BMM) ont été obtenus à partir de tibias et de fémurs de souris mâles âgées de 6 à 8 semaines. Les cellules de moelle osseuse ont été rincées et collectées avec un milieu essentiel α-minimal complet (α-MEM, 10% de sérum bovin fœtal [FBS] et pénicilline / streptomycine). Les cellules ont été cultivées avec un milieu α-MEM complet en présence de facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF; 10 ng/ml, R&D Systems) pendant 1 jour. Les cellules en suspension ont été recueillies et inoculées sur une lame de verre ou un flash de culture. Les cellules ont été cultivées dans un milieu complet induit avec 30 ng/ml de M-CSF et 50 ng/ml d'activateur du récepteur du ligand du facteur nucléaire kB (RANKL; R&D Systems). Le milieu de culture a été remplacé tous les 2 jours.

La coloration TRAP a été réalisée à l'aide d'un kit de phosphatase acide selon les instructions du fabricant (Sigma-Aldrich, catalogue n° 387). Les cellules cultivées pendant une période donnée ont été lavées avec une solution de tampon phosphate (PBS) et fixées avec du formaldéhyde à 4% pendant 5 min à température ambiante et rincées abondamment dans du PBS. Les cellules ont été incubées dans une solution de coloration TRAP à 37 ° C pendant 0,5 à 1 h à l'abri de la lumière. Après élimination de la solution TRAP, les plaques ont été lavées trois fois avec de l'eau distillée. Les cellules multinucléées TRAP-positives contenant trois noyaux ou plus ont été comptées sous un microscope inversé (Nikon).

Les tibias de souris ont été écorchés et fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 48 h. Les tibias ont été décalcifiés avec 10 % d'EDTA pendant 10 à 15 jours, puis déshydratés et enrobés de paraffine. Des sections de 5 à 7 μm ont été préparées sur un microtome rotatif. Les sections ont été déparaffinées et incubées avec une solution de coloration TRAP à 37 ° C pendant 1 h à l'abri de la lumière. Le vert de méthyle a été utilisé pour la contre-coloration. Les images ont été acquises au microscope et les analyses statistiques ont été effectuées avec le système d'analyse BioquantOsteo.

L'ARN total a été extrait des cellules ou des tissus à l'aide du réactif TRIzol conformément aux instructions du fabricant. La transcription inverse a été réalisée avec 0,5 µg d'ARN total dans un volume total de 10 µl par réaction. L'ARN a été rétrotranscrit en ADNc avec le kit de réactifs PrimeScript RT (Takara, RR037A) conformément aux instructions du fabricant. PCR quantitative en temps réel (QRT-PCR) à l'aide d'un TB Green™ Premix Ex Taq™ II (Takara, RR820A). Gapdh a été utilisé comme contrôle de normalisation pour l'ARNm. Toutes les amorces ont été fabriquées par BGI (Pékin, Chine). Les amorces suivantes ont été utilisées : Gapdh F : ACATCATCCCTGCATCCACTG, R : TCATTGAGAGCA ATGCCAGC ; NFATc1 F : ACGCTACAGCTGTTCATTGG, R : CTTTGGTGTTGGACAGGATG ; Acp5 F : GCGACCATTGTTAGCCACATACG, R : CGTTGATGTCGCACAGAGGGAT; Mmp9 F : GCTGACTACGATAAGGACGGCA, R : GCGGCCCTCAAAGATGAACGG ; Ctsk F : GCGTTGTTCTTATTCCGAGC, R : CAGCAGAGGTGTGTACTATG ; Ano1 F : CCCGTGCCAGTCACCTTTTT, R : TCATCTGCTCCGTTTCCAGT.

Les cellules ont été lysées dans un tampon de lyse (tampon RIPA, PMSF 1 mM, cocktail inhibiteur de phosphatase et cocktail inhibiteur de protéase) sur de la glace pendant 15 min. Les tissus osseux ont été broyés avec un mortier dans de l'azote liquide et ont été lysés dans un tampon de lyse à 4 °C pendant 30 min. Les fractions protéiques ont été recueillies par centrifugation à 12 000 × g, 4 ° C pendant 10 min, puis 10 mg de lysats ont été soumis à SDS-PAGE et transférés sur des membranes à membrane filtrante en nitrocellulose (NC). Les membranes ont été bloquées avec du lait écrémé à 5 % et incubées avec des anticorps spécifiques pendant une nuit. Les anticorps utilisés étaient listés : lapin anti-NFATc1 (1:1000, abclonal, A1539), lapin anti-Ano1 (1:1000, abclonal, A10498), lapin anti-p-CaMKIV anticorps (1:1000, ImmunoWay, YP0043), lapin anti-CaMKIV (1:1000, Cell Signaling Technology, 4032), lapin anti-Creb anticorps (1:1000, Cell Signaling Technology, 9197), anticorps de lapin anti-p-Creb (1:1000, Cell Signaling Technology, 9198), anticorps de lapin anti-Gapdh (1:5000, Abways, AB0036).

L'écoulement de fluide a été appliqué aux cellules dans une chambre d'écoulement à plaques parallèles à l'aide d'une boucle d'écoulement fermée. Les ostéoclastes ont été ensemencés à une densité de 4 × 106 cellules sur des lamelles en verre de 22 × 26 mm et cultivés dans un milieu α-MEM avec RANKL et M-CSF pendant 3 jours. Les lamelles ont été placées dans la chambre d'écoulement à plaques parallèles et traitées avec 12 dyn/cm2 FSS 30 min/jour, l'appareil a été maintenu à 37 °C pendant toute la durée de l'expérience. La corrélation entre le FSS et le débit a été calculée à l'aide de l'équation : τ = 6μQ/bh2, où Q est le débit (cm3/s), μ est la viscosité du fluide d'écoulement (0,01 dynes/cm2), h est la hauteur du canal (0,05 cm), b est la largeur de la fente (2,5 cm) et τ est la contrainte de cisaillement de la paroi (dyne/cm2). La chambre d'écoulement à plaques parallèles a été décrite précédemment8,46.

Une centrifugeuse à hypergravité a été utilisée pour détecter les effets de l'hypergravité sur les ostéoclastes. Dans cette étude, les ostéoclastes ont été ensemencés à une densité de 107 cellules sur un flacon de culture cellulaire de 12,5 cm2 et cultivés dans un milieu α-MEM avec RANKL (50 ng/ml) et M-CSF (30 ng/ml) pendant 3 jours. Pour éviter la présence de bulles d'air, les flacons ont été remplis de milieu de culture. Les flacons ont été soigneusement fixés au panneau rotatif de la centrifugeuse à hypergravité et mis en rotation à une vitesse constante de 4 g en condition d'hypergravité à 37 ° C. Pour le contrôle, les cellules ont été cultivées de la même manière mais sans clinorotation (1 g). La centrifugeuse à hypergravité a été décrite précédemment32.

Nous avons utilisé un clinostat 2D pour simuler la microgravité. Le clinostat 2D a été conçu et fourni par le Centre chinois de recherche et de formation des astronautes (Pékin, Chine). La rotation provoque un vecteur de gravité qui n'est pas reconnaissable par les cellules. Par conséquent, l'appareil empêche les cellules de ressentir la gravité. Les méthodes de traitement des ostéoclastes ont suivi la description de la microgravité simulée par rotation. Les flacons ont été soigneusement fixés au panneau rotatif du système clinostat et mis en rotation à une vitesse constante de 30 tr/min/min pour simuler la microgravité (0,01 g). Pour le contrôle, les cellules ont été cultivées de la même manière mais sans clinorotation (1 g). Le clinostat 2D a été décrit précédemment8,32.

Les ostéoclastes ont été incubés avec du MQAE 5 mM (Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Chine) pendant 30 min, puis rincés cinq fois avec du PBS. Les images de fluorescence cellulaire ont été réalisées à l'aide d'une microscopie confocale à balayage laser (CLSM, Leica SP5, Allemagne) avec une lumière d'excitation de 350 nm et une lumière d'émission de 460 nm. Les changements de [Cl-]i étaient représentés par les changements d'intensité de fluorescence. L'intensité de fluorescence moyenne de chaque cellule a été analysée par le logiciel Image J.

La procédure de déchargement des membres postérieurs a été réalisée par suspension de la queue. Toutes les souris mâles ont été maintenues dans des conditions d'élevage standard. Les souris mâles Ano1fl/fl et Ctsk-Cre;Ano1fl/fl de 3 mois ont été individuellement mises en cage et suspendues par la queue à l'aide d'une bande de ruban chirurgical adhésif attachée à une chaîne suspendue à une poulie. Les souris ont été suspendues à un angle de 30° par rapport au sol, seuls les membres antérieurs touchant le sol, ce qui a permis aux souris de se déplacer et d'accéder librement à la nourriture et à l'eau. Les souris ont été soumises à un déchargement des membres postérieurs par suspension de la queue pendant 28 jours. Nous avons injecté de la calcéine (30 mg/kg, sigma) par voie intrapéritonéale à des souris 10 jours et 2 jours avant l'euthanasie pour marquer la nouvelle formation osseuse. Après l'euthanasie, le sérum et les tissus osseux entiers ont été prélevés. Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par les comités d'éthique animale et de sécurité expérimentale du Centre de recherche et de formation des astronautes de Chine.

Selon un protocole30, nous avons chargé le tibia gauche de souris femelles Ctsk-Cre;Ano1fl/fl et Ano1fl/fl âgées de 16 semaines avec une contrainte maximale de +1200 με au niveau de la diaphyse à l'aide d'un Electroforce BOSE 5100. Le tibia gauche de chaque souris a été chargé pendant cinq jours consécutifs par semaine pendant 2 semaines (jour 1–5 et jour 8–12), et la charge a été appliquée en 1200 cycles avec Forme d'onde triangulaire de 4 Hz et temps de repos de 0,1 s entre chaque cycle. Après l'euthanasie, des tissus osseux ont été prélevés au jour 15.

Les fémurs de souris ont été écorchés et fixés dans de l'éthanol à 75 %. Pour le fémur distal et le tibia proximal, l'intégralité de la spongieuse secondaire du fémur distal et du tibia proximal de chaque souris a été scannée ex vivo à l'aide d'un système microCT (mCT40, SCANCO MEDICAL, Suisse). En bref, 80 tranches d'os trabéculaire proximales à la plaque de croissance distale ont été sélectionnées pour analyser le volume osseux par volume tissulaire (BV/TV), le nombre trabéculaire (Tb.N), l'épaisseur trabéculaire (Tb.Th) et l'espacement trabéculaire (Tb.Sp).

Les analyses ont été effectuées selon les instructions du fabricant pour les concentrations sériques de CTX-1 avec le kit ELISA CTX1 de souris (Sangon Biotech, D721204). Ce dosage utilise la technique de dosage immunoenzymatique en sandwich. Ajouter l'étalon et l'échantillon à la microplaque pré-enduite d'anticorps anti-souris CTX1. Après incubation, ajouter l'anticorps anti-souris CTX1 conjugué à la biotine. Il est ensuite combiné avec de la streptavidine conjuguée à la HRP pour former un complexe immun, puis incubé et lavé pour éliminer l'enzyme non liée, puis ajouté au substrat chromogénique TMB pour produire une couleur bleue, et converti en jaune final sous l'action de l'acide. Enfin, la valeur d'absorbance (DO) a été mesurée à 450 nm. La concentration de souris CTX1 dans l'échantillon était proportionnelle à la valeur de DO. La concentration de souris CTX1 dans l'échantillon peut être calculée en traçant une courbe standard.

Des expériences cellulaires ont été réalisées au moins trois répétitions indépendantes. Les animaux ont été randomisés en différents groupes et au moins 5 souris ont été utilisées pour chaque groupe. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± sem. Le test t de Student a été utilisé pour les évaluations statistiques des comparaisons de deux groupes. L'analyse statistique avec plus de deux groupes a été réalisée avec une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA). Toutes les analyses statistiques ont été réalisées avec le logiciel Prism (Graphpad prism for windows, version 8.0). Les différences étaient considérées comme significatives à *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Les données générées ou analysées au cours de cette étude sont fournies dans l'article principal (Fig. 1 à 8) et dans les figures supplémentaires (Fig. 1 à 4 supplémentaires). Les images originales de gel et de transfert sont présentées dans les figures supplémentaires. 5–8. Les données sources des graphiques et des images se trouvent dans les fichiers Excel supplémentaires (Données supplémentaires). Toutes les ressources sont également disponibles auprès des auteurs sur demande raisonnable.

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Nous remercions Min-Sheng Zhu (Université de Nanjing, Nanjing, Chine) pour avoir fourni les souris floxées ANO1, Weiguo Zou (Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Chine) pour avoir fourni les souris Ctsk-Cre. Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81830061, 82192882 à Yingxian L., 82072108 à Yuheng L. et 32000879 à JL), Space Medical Experiment Project of China Manned Space Program (HYZHXM01006) à YingxianL.

Laboratoire clé de Pékin pour la séparation et l'analyse en biomédecine et produits pharmaceutiques, Institut de technologie de Pékin, Pékin, Chine

Weijia Sun et Rongji Dai

State Key Laboratory of Space Medicine Fundamentals and Application, China Astronaut Research and Training Center, Pékin, Chine

Weijia Sun, Yuheng Li, Jianwei Li, Yingjun Tan, Xinxin Yuan, Guohui Zhong, XiaoYan Jin, Zizhong Liu, Ruikai Du, Wenjuan Xing, Dingsheng Zhao, Jinping Song, Youyou Li, Junjie Pan, Yunzhang Zhao, Qi Li et Yingxian Li

Institut d'orthopédie, Hôpital général chinois de l'APL, Pékin, Chine

Haoye Meng, Jianting Ye et Aiyuan Wang

Laboratoire Oujiang (Laboratoire du Zhejiang pour la médecine régénérative, la vision et la santé cérébrale), Wenzhou, Zhejiang, Chine

Shukuan Ling

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WS a conçu et réalisé la majorité des expériences, analysé les données et préparé le manuscrit ; Yuheng L. a contribué à l'analyse μCT ; JL a conçu les expérimentations animales ; YT a contribué au clinostat, à la centrifugeuse à hypergravité et aux installations de contrainte de cisaillement des fluides. HM, JY et AW ont fourni un dispositif de chargement mécanique et un système d'analyse, GZ, XY et XJ ont aidé au traitement in vivo ; DZ, ZL, RDWX et JS ont fourni des suggestions pour la préparation du manuscrit Youyou L., JP, YZ et QL ont fourni un support matériel expérimental ; SL, RD et Yingxian L. ont dirigé l'étude et révisé l'article.

Correspondance avec Shukuan Ling, Rongji Dai ou Yingxian Li.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Zhousheng Xiao et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Principales rédactrices en chef : Martina Rauner et Christina Karlsson Rosenthal.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Sun, W., Li, Y., Li, J. et al. La stimulation mécanique contrôle la fonction des ostéoclastes par la régulation du canal Cl− activé par Ca2+ Anoctamin 1. Commun Biol 6, 407 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04806-1

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Reçu : 24 août 2022

Accepté : 04 avril 2023

Publié: 13 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04806-1

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