Le silençage épigénétique par le complexe SMC5/6 médie le VIH

Sep 15, 2023

Nature Microbiology volume 7, pages 2101–2113 (2022)Citer cet article

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Après l'entrée virale et la transcription inverse, les provirus du VIH-1 qui ne parviennent pas à s'intégrer sont réduits au silence sur le plan épigénétique, mais le mécanisme sous-jacent est resté incertain. À l'aide d'un écran knock-out CRISPR/Cas9 à l'échelle du génome, nous avons identifié le complexe hôte SMC5/6 comme essentiel pour ce silençage épigénétique. Nous montrons que SMC5/6 se lie à l'ADN du VIH-1 chromatinisé non intégré puis SUMOylate. L'inhibition de la SUMOylation, soit par mutagenèse ponctuelle du composant SMC5/6 NSMCE2 - une SUMO E3 ligase - soit à l'aide de l'inhibiteur de SUMOylation TAK-981, empêche le silençage épigénétique, permet la transcription à partir de l'ADN du VIH-1 non intégré et sauve la réplication du VIH-1 déficient en intégrase. Enfin, nous montrons que le blocage de l'expression du complexe SMC5/6, ou l'inhibition de son activité de SUMOylation, supprime l'établissement d'infections latentes par le VIH-1 dans les lignées cellulaires T CD4+ et les cellules T humaines primaires. Collectivement, nos données montrent que le complexe SMC5/6 joue un rôle direct dans la médiation de l'établissement de la latence du VIH-1 en faisant taire épigénétiquement les provirus VIH-1 compétents pour l'intégration avant l'intégration.

L'intégration de l'ADN proviral dans le génome de la cellule hôte est une caractéristique déterminante du cycle de vie rétroviral qui est essentielle pour la transcription et la réplication provirales1,2. Les inhibiteurs de l'intégrase (IN) inhibent puissamment la réplication du VIH-13. En l'absence d'IN fonctionnel, les provirus VIH-1 non intégrés accumulent des marques épigénétiques répressives, notamment la triméthylation de la lysine 9 sur l'histone H3 (H3K9me3), et sont dépourvus de marques activatrices, telles que l'acétylation H3 (H3Ac)4,5. Alors que le silençage épigénétique de la transcription de l'ADN non intégré du VIH-1 représente probablement une défense de l'hôte contre l'ADN étranger, les mécanismes sous-jacents et les facteurs cellulaires qui interviennent dans cet effet restent incomplètement définis6,7.

Dans le virus de la leucémie murine (MLV), un criblage génomique a identifié les composants du complexe du concentrateur de silence humain (HUSH), ainsi que la protéine de liaison à l'ADN NP220, comme essentiels pour le silençage de l'ADN du MLV non intégré8. Cependant, des travaux ultérieurs9,10 n'ont détecté aucun rôle du complexe HUSH ou de NP220 dans le silence du VIH-1 non intégré. Plus récemment, un criblage de 1 217 gènes humains trouvés régulés à la baisse par la protéine Vpr du VIH-1 a identifié un composant du complexe de maintien structurel du chromosome (SMC) 5/6, le facteur de localisation complexe SMC5/6 2 (SLF2), comme essentiel pour le silençage de l'ADN du VIH-1 non intégré. Cet écran a également montré que six autres composants du complexe SMC5/6, y compris SMC5 et 6 ainsi que les quatre protéines associées à SMC5/6 maintien non structurel des éléments chromosomiques 1 à 4 (NSMCE1–4), mais pas le SMC5/6 facteur associé SLF1, étaient également critiques pour le silençage épigénétique de l'ADN non intégré du VIH-19. Il convient de noter qu'il a été précédemment démontré que le complexe SMC5/6 était dégradé par la protéine non structurelle HBX du virus de l'hépatite B (VHB) et, en l'absence de HBX, l'ADN épisomique du VHB est également réduit au silence épigénétiquement11,12. Ainsi, le complexe SMC5/6 participe non seulement à la réplication, la recombinaison et la réparation chromosomiques13 mais peut également faire taire l'ADN viral invasif. Ici, nous avons cherché à déterminer si le complexe SMC5/6 intervient dans l'établissement d'infections latentes par le VIH-1.

Pour identifier les facteurs qui réduisent au silence la transcription de l'ADN du VIH-1 non intégré, nous avons effectué un criblage de knock-out CRISPR/Cas9 à l'échelle du génome dans la lignée de cellules T CD4+ humaines CEM-SS. Nous avons transduit un sous-clone CEM-SS qui exprime Streptococcus pyogenes Cas9 avec une bibliothèque lentivirale exprimant environ 80 000 ARN à guide unique (ARNsg) ciblant 19 114 gènes humains15. Sept jours plus tard, nous avons infecté ces cellules avec IN-NL-GFPΔEnv10, un dérivé du VIH-1 portant une délétion dans env, la mutation inactivante D64V16 dans IN et le cadre de lecture ouvert de la protéine fluorescente verte (GFP) à la place de nef. Ce virus conserve des copies intactes des six autres gènes du VIH-1, y compris vpr. A 48h post infection (hpi), les cellules GFP+ ont été collectées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), les sgRNAs récupérés par PCR (amplification en chaîne par polymérase) puis clonés dans le même vecteur lentiviral. Après trois cycles de sélection pour les cellules GFP +, les sgRNA ont été séquencés et analysés pour l'enrichissement par rapport à la bibliothèque de sgRNA de départ. Comme le montre le diagramme du volcan de la Fig. 1a, nous avons identifié 9 gènes enrichis> 16 fois et ayant une valeur P <0, 0005. Ceux-ci comprenaient 3 récepteurs de surface cellulaire (LY9, OR52N2 et SSTR2) et 1 protéine motrice (MYO1B) qui n'ont pas été analysés plus avant. Cette analyse a également récupéré 4 des 8 composants connus du complexe SMC5/6, à savoir SMC5, SMC6, SLF1 et NSMCE3, ainsi que la protéine de réparation de l'ADN SWI5 (Fig. 1a).

a, Volcano plot du changement de pli moyen des sgARN spécifiques à chaque gène et leurs valeurs P corrigées du taux de fausse découverte (FDR). Les gènes avec changement de pli> 16 et valeur P <0, 0005 (délimités par les lignes rouges) sont étiquetés. En bref, les valeurs P pour les sgRNA individuels ont été calculées à l'aide d'un modèle binomial négatif (NB), puis les valeurs P sgRNA triées ont été utilisées pour calculer les valeurs P corrigées par FDR pour les gènes individuels à l'aide de l'algorithme d'agrégation de rang robuste (αRRA) dans MAGeCK-VISPR50,51. Les membres du complexe SMC5/6 sont en vert (valeurs P corrigées par FDR : SMC5 = 7,8 × 10−7, SMC6 = 0,00033, NSMCE3 = 0,00010, SLF1 = 0,00017). b, cytométrie en flux de cellules WT CEM-SS et des lignées cellulaires clonales knock-out indiquées à 2 dpi avec un virus rapporteur IN-NL-GFPΔEnv à un MOI d'environ 0, 3. Une expérience représentative de 3 répétitions biologiques est présentée. c, d, cytométrie en flux de cellules WT (c) ou ΔSMC5 CEM-SS (d) à 2 dpi avec le virus rapporteur IN + NL-GFPΔEnv à un MOI d'environ 0, 3. Des expériences représentatives de 3 répétitions biologiques sont présentées. e–h, Évolution dans le temps de l'infection des cellules parentales CEM-SS Cas9, ou des clones ∆SMC5 et ∆SLF2 CEM-SS avec IN+ ou IN− NL-NLuc. e, cellules vivantes. f, expression NLuc codée viralement. g, ADN total du VIH-1. h, expression totale de l'ARN du VIH-1 quantifiée au dpi indiqué. Toutes les cultures IN+ infectées par le VIH-1 sont mortes de cytopathicité virale à 7 dpi. Les niveaux d'ADN et d'ARN ont été quantifiés par qPCR et normalisés aux cellules CEM-SS Cas9 infectées par le VIH-1 IN + à 1 dpi, qui a été réglé sur 1. Moyenne ± sd de 3 réplicats biologiques.

Données source

Pour confirmer l'importance de ces cinq protéines, ainsi que des quatre autres composants connus du complexe SMC5/6 (NSMCE1, 2 et 4 et SLF2), nous avons inhibé leur expression dans les cellules CEM-SS Cas9 à l'aide de deux sgARN indépendants (Extended Data Fig. 1). La suppression de l'un des huit composants SMC5 / 6 a considérablement amélioré l'expression de la GFP à partir du vecteur IN-NL-GFPΔEnv. Comme l'inactivation de SWI5 n'a eu aucun effet, ce gène a été considéré comme un faux positif.

Nous avons ensuite généré des lignées cellulaires clonales knock-out dans des cellules CEM-SS, pour SMC5, SMC6, NSMCE2, NSMCE4, SLF1 et SLF2. Dans chaque cas, à l'exception de NSMCE2, nous avons généré deux lignées cellulaires knock-out indépendantes pour éviter une éventuelle variation clonale. Ces knockouts de gène ont été vérifiés en identifiant des mutations de décalage de cadre inactivantes par séquençage d'ADN (tableau supplémentaire 1) et par Western blot (données étendues Fig. 2). Les cellules mutantes ont montré la même cinétique de croissance que les cellules CEM-SS de type sauvage (WT) (Extended Data Fig. 3). L'infection de ces lignées cellulaires à l'aide du rapporteur IN-NL-NLucΔEnv, dans lequel la GFP a été remplacée par la nano luciférase (NLuc) 10, a révélé une récupération partielle de l'expression de NLuc à partir de l'ADN du VIH-1 non intégré (Extended Data Fig. 3d). De plus, l'infection de ces clones knock-out avec le virus IN-NL-GFPΔEnv à une multiplicité d'infection (MOI) d'environ 0, 3 a révélé un niveau similaire de cellules GFP + (de 29% à 43% positifs, Fig. 1b) à celui observé dans les cellules WT CEM-SS infectées par une forme IN + de NL-GFPΔEnv (32% positifs, Fig. 1c), bien que le virus IN + ait induit une intensité de fluorescence moyenne plus élevée. L'infection de cellules ΔSMC5 CEM-SS avec la forme IN + de NL-GFPΔEnv a donné beaucoup plus de cellules GFP + par rapport aux cellules WT CEM-SS (Fig. 1c vs 1d). Comme l'intégration provirale du VIH-1 est inefficace17, nous émettons l'hypothèse que cette augmentation résulte de la transcription de l'ADN IN+ du VIH-1 non intégré. L'infection de cellules WT CEM-SS par le virus IN-NL-GFPΔEnv n'a généré aucune cellule GFP + (Fig. 1b).

Nous nous sommes demandé si les cellules dépourvues de la fonction complexe SMC5/6 soutiendraient la réplication de IN− HIV-1. Comme le montre la Fig. 1e – h, IN− HIV-1 portant la mutation inactivante de l'intégrase D64V a en effet établi des infections propagées dans les sous-clones ΔSMC5 et ΔSLF2, atteignant des niveaux substantiels d'expression virale d'ADN, d'ARN et de protéines 14 jours après l'infection (dpi) lorsqu'il est cultivé en présence de raltégravir pour prévenir toute mutation révertante. Aucune réplication de IN− HIV-1 n'a été observée dans les cellules WT CEM-SS (Fig. 1f – h). La réplication IN− du VIH-1 dans des cellules dépourvues de complexes SMC5/6 fonctionnels a provoqué une cytopathicité virale qui a tué toute la culture à 16 dpi (Fig. 1e). Fait important, à 14 dpi, la mutation inactivante D64V IN a été entièrement conservée. De plus, alors que 2 longs cercles répétés terminaux (2LTR) caractéristiques de l'ADN du VIH-1 non intégré ont été détectés dans des cultures infectées par les virus IN + et IN-, le VIH-1 intégré détecté en quantifiant les intégrations dans les régions de répétition Alu du génome par PCR quantitative basée sur Alu (Alu-qPCR) 18 n'était présent que dans le premier (données étendues Fig. 3b, c). Ainsi, alors que la réplication de IN− HIV-1 dans les cellules dépourvues du complexe SMC5/6 est certainement plus lente que IN+ HIV-1 (Fig. 1f – h), il est remarquable que IN− HIV-1 puisse se répliquer.

La répression épigénétique de l'ADN du VIH-1 non intégré est corrélée à l'ajout de la modification répressive de l'histone H3K9me3 et à la perte des modifications activatrices H3Ac et H3K4me34,10. Nous avons donc testé si la perte du complexe SMC5/6 empêcherait le silençage épigénétique. L'analyse de l'ajout des modifications activatrices H3Ac et H3K4me3 à l'ADN IN- HIV-1 non intégré a révélé un niveau similaire à celui observé avec IN + HIV-1 dans les sous-clones ΔSMC5 et ΔSLF2 (données étendues Fig. 4a, b). De même, les cellules dépourvues du complexe SMC5 / 6 présentaient des modifications H3K9me3 inhibitrices perdues sur l'ADN du VIH-1 non intégré (données étendues Fig. 4c). En revanche, ni le niveau de liaison totale de l'histone H3 à l'ADN viral (données étendues Fig. 4d) ni le niveau de H3K27me3 (données étendues Fig. 4e) n'ont été sensiblement affectés.

Bien qu'il ait été rapporté que la protéine Vpr du VIH-1 améliore l'expression génique de l'ADN du VIH-1 non intégré9,19 et dégrade le composant SMC5/6 SLF29, nous avons précédemment rapporté que la surexpression de Vpr n'améliore pas l'expression génique de l'IN-VIH-110, et les virus WT Vpr+ sont fortement inhibés par les inhibiteurs de l'intégrase3. Pour tester l'effet de Vpr sur l'expression des gènes viraux non intégrés, nous avons infecté des cellules WT ou ΔSMC5 CEM-SS avec le virus IN− NL-GFPΔEnv ± Vpr et n'avons vu aucune différence discernable (Extended Data Fig. 5).

Le complexe SMC5/6 SUMOylate plusieurs substrats protéiques, dont lui-même13, via la SUMO E3 ligase NSMCE220,21. L'activité de SUMOylation, qui est stimulée par la liaison à l'ADN22, est essentielle pour le rôle du complexe SMC5/6 dans la réparation et la recombinaison de l'ADN13. Plusieurs composants de la chromatine, y compris l'histone H4, peuvent être SUMOylés et la SUMOylation de l'histone est associée à la répression transcriptionnelle23,24. Pour déterminer si la SUMOylation de la chromatine par SMC5/6 contribue au silence épigénétique de l'ADN du VIH-1 non intégré, nous avons éliminé NSMCE2 dans les cellules CEM-SS, comme confirmé par le séquençage de l'ADN (tableau supplémentaire 1) et le transfert Western (données étendues, Fig. 2). La perte de NSMCE2 a sauvé l'expression de la GFP du virus IN-NL-GFPΔEnv. Ce sauvetage a été bloqué lors de l'expression ectopique de WT NSMCE2 mais pas du mutant NSMCE2ΔSUMO, qui manque d'activité de SUMOylation en raison de mutations C185S / H187Q introduites dans le domaine essentiel du doigt RING25 (Fig. 2a). Un résultat similaire a été observé avec le virus rapporteur IN-NL-NLucΔEnv en ce que la perte d'expression de NSMCE2 dans le sous-clone ΔNSMCE2 a sauvé l'expression de NLuc de l'ADN du VIH-1 non intégré et ce sauvetage a été bloqué par l'expression de WT mais pas du mutant NSMCE2 (Fig. 2b). Cela n'était pas dû à l'instabilité du mutant NSMCE2ΔSUMO (Fig. 2c). De plus, les formes WT et ΔSUMO de NSMCE2 ont lié l'ADN du VIH-1 non intégré et la perte d'expression de NSMCE2 n'a pas inhibé le recrutement du composant SMC5 du complexe SMC5 / 6 à l'ADN viral (Fig. 2d). L'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) - qPCR utilisant un anticorps spécifique de SUMO2 / 3 dans les cellules WT CEM-SS, ΔNSMCE2 et ΔSMC5 infectées par IN-NL-GFP a facilement détecté la modification SUMO sur l'ADN du VIH-1 chromatinisé non intégré dans les cellules WT mais pas dans les cellules dépourvues de NSMCE2 ou SMC5, qui présentaient des niveaux de fond de liaison d'anticorps (Fig. 2d, e).

a, Cytométrie en flux à 2 dpi de cellules T WT ou ∆NSMCE CEM-SS transduites avec un vecteur lentiviral n'exprimant rien, FLAG-NSMCE2 ou le mutant FLAG-NSMCE2∆SUMO puis infectées avec IN−NL-GFPΔEnv à une MOI de ~0,3. Montré est une expérience représentative de 3 répétitions biologiques. b, Quantification de l'expression virale de NLuc dans les cellules indiquées infectées par IN+ ou IN- NL-NLucΔEnv. L'expression de NLuc a été normalisée par rapport à l'infection IN-VIH-1 des cellules WT CEM-SS, qui a été fixée à 1 (** P = 0, 0010, *** P = 0, 0009, **** P < 0, 0001, analyse de variance à 1 facteur (ANOVA), test de Dunnett). c, Western blot représentatif de WT FLAG-NSMCE marqué FLAG et de l'expression de NSMCE2∆SUMO après transduction des types de cellules indiqués. d, quantification par puce – qPCR du niveau de NSMCE2 marqué par FLAG, exprimé de manière ectopique, ou de SMC5 endogène à l'ADN IN− HIV-1 non intégré dans les cellules T WT ou ∆NSMCE CEM-SS. Le dépôt de SUMO2/3 a également été déterminé par ChIP–qPCR (ΔNSMCE2 + NSMCE2 ***P = 0,0002, ΔNSMCE2 + NSMCE2ΔSUMO ***P = 0,0003 ; ANOVA à 2 voies, test de Dunnett). e, Quantification du niveau de dépôt de SUMO2/3 sur le LTR du VIH-1 à 2 dpi dans les cellules WT et ∆SMC5 CEM-SS infectées par IN-NL-GFPΔEnv. L'IgG a servi de contrôle négatif (**** P < 0,0001, ANOVA à 2 voies, test de Sidak). Les données en b, d et e sont la moyenne ± sd de 3 répétitions biologiques.

Données source

Si la SUMOylation de la chromatine est cruciale pour le silençage épigénétique de l'ADN du VIH-1 non intégré, alors les médicaments qui inhibent la SUMOylation devraient sauver l'expression génique par IN-VIH-1. Le médicament anticancéreux TAK-981 est un inhibiteur spécifique de l'enzyme activatrice de SUMO, qui catalyse la première étape de la protéine SUMOylation26. Nous avons réalisé une expérience dose-réponse TAK-981 dans des cellules WT CEM-SS ainsi que dans le sous-clone ΔSMC5 après infection avec le rapporteur IN-NL-NLucΔEnv. Des niveaux de TAK-981, de 5 nM à 1 000 nM, ont été ajoutés à 0 dpi, les cellules lysées et les niveaux de NLuc quantifiés à 2 dpi. TAK-981 a en effet stimulé l'expression de NLuc à partir de l'ADN du VIH-1 non intégré, atteignant un plateau à ~ 75 nM où le niveau d'expression de NLuc à partir du vecteur IN-NL-NLucΔEnv dans les cellules WT était égal au niveau induit dans les cellules ΔSMC5 (Fig. 3a). En revanche, TAK-981 n'a eu aucun effet sur l'expression génique du rapporteur IN-NL-NLucΔEnv dans les cellules ΔSMC5 à toutes les doses testées, arguant que l'effet positif de TAK-981 sur l'expression génique de l'ADN du VIH-1 non intégré dans les cellules WT CEM-SS était entièrement dû à l'inhibition de la fonction SMC5/6.

a, Expression virale de NLuc à 2 dpi dans des cellules WT et ∆SMC5 CEM-SS infectées par IN−NL-NLucΔEnv et traitées avec les concentrations indiquées de TAK-981 à partir du jour 0 (****P < 0,0001, *P = 0,015 ; ANOVA à 2 voies, test de Sidak). b, niveaux d'ARN viral pour l'ARN non épissé (ARNm Gag), épissé individuellement (A1D1) et épissé plusieurs fois (A4D7) dans les cellules CEM-SS infectées par IN + ou IN- HIV-1 ± 150 nM de TAK-981, mesuré à 2 dpi. Les niveaux d'ARN ont été normalisés par rapport aux infections WT HIV-1 sans TAK-981, qui a été défini sur 1, et les statistiques ont été calculées à l'aide d'un test t de Welch non apparié à 2 queues (Gag : *P = 0,037, ***P = 0,004 ; A1D1 : *P = 0,033, **P = 0,0012 ; A4D7 : **P = 0,0059, **P = 0. 0078). c, Expression virale de NLuc à 3 dpi dans des cellules WT et ∆SMC5 CEM-SS infectées par IN-NL-NLucΔEnv, avec 150 nM de TAK-981 ajoutés au hpi indiqué. L'expression de NLuc est donnée par rapport aux cellules WT CEM-SS non traitées avec TAK-981, qui a été réglée sur 1. d–f, ChIP–qPCR pour quantifier les quantités de SUMO2/3 (d), H3Ac (e) et H3K9me3 (f) déposées sur le LTR du VIH-1 à 3 dpi. TAK-981 (150 nM) a été ajouté au hpi indiqué. Les données de d–f ont été analysées à l'aide de l'ANOVA à 2 voies, test de Tukey (****P < 0,0001, **P = 0,0012). Les données de a à f sont la moyenne ± sd de 3 répétitions biologiques.

Données source

Pour traiter l'effet de TAK-981 sur l'expression de l'ARNm du VIH-1, nous avons utilisé la qPCR pour quantifier le niveau de transcrits du VIH-1 non épissés, épissés individuellement et entièrement épissés dans les cellules T WT CEM-SS infectées par WT ou IN− HIV-1 en présence ou en l'absence de 150 nM de TAK-981 (Fig. 3b). TAK-981 a augmenté modestement mais significativement l'expression des espèces d'ARN viral par IN+ HIV-1 et a fortement stimulé l'expression des trois classes d'ARN viral de IN− HIV-1.

Pour déterminer si le moment de l'ajout de TAK-981 affecterait différemment l'expression du gène viral à partir de l'ADN du VIH-1 non intégré, nous avons infecté des cellules WT ou ΔSMC5 CEM-SS avec IN− NL-NLuc ΔEnv, puis ajouté TAK-981 à différents moments de 0 à 48 hpi (Fig. 3c). A 72 hpi, les cellules ont été lysées et l'activité NLuc déterminée. L'ajout de TAK-981 à 0 hpi a sauvé l'expression de NLuc du virus rapporteur IN-NL-NLucΔEnv au niveau observé dans le sous-clone ΔSMC5 et cela est resté vrai jusqu'à 24 hpi. Cependant, le sauvetage de l'expression de NLuc par TAK-981 était plus faible de 36 hpi et indétectable à 48 hpi. Pour déterminer si l'ajout de TAK-981 inhibait effectivement la SUMOylation de l'ADN du VIH-1 chromatinisé non intégré, nous avons effectué une ChIP-PCR pour déterminer le niveau de SUMO présent sur la LTR virale dans les cellules WT CEM-SS, en présence et en l'absence de 150 nM TAK-981, et dans le clone ΔSMC5, à 3 dpi avec IN-NL-NLucΔEnv. L'ajout de TAK-981 a entraîné la perte de SUMO à partir de l'ADN du VIH-1 non intégré, que le médicament ait été ajouté tôt ou tard après l'infection (Fig. 3d). Ainsi, même si le TAK-981 est inefficace pour sauver l'expression génique de l'ADN du VIH-1 non intégré s'il est ajouté à 36 hpi ou plus tard (Fig. 3c), il reste efficace pour empêcher le maintien de la modification dynamique SUMO sur l'ADN viral (Fig. 3d). Ces données suggèrent que la SUMOylation par SMC5/6 déclenche le silençage épigénétique de l'ADN du VIH-1 non intégré mais n'est pas nécessaire pour maintenir l'état silencieux. Cette hypothèse a été étayée par une analyse ChIP – qPCR des modifications épigénétiques présentes sur l'ADN viral non intégré en présence et en l'absence de TAK-981 (Fig. 3e, f). L'ajout de 150 nM de TAK-981 à 16 hpi ou 24 hpi a sauvé l'ajout de la modification épigénétique activante H3Ac à l'ADN du VIH-1 chromatinisé non intégré et a bloqué l'ajout du marqueur répressif H3K9me3. En revanche, à 36 hpi, le TAK-981 était inefficace pour inverser le silençage épigénétique de l'ADN du VIH-1 non intégré. Ainsi, le TAK-981 peut empêcher la répression épigénétique de l'IN-VIH-1 s'il est appliqué tôt après l'infection, mais il est incapable de sauver les provirus IN-VIH-1 préexistants et épigénétiquement réduits au silence et ne fonctionne donc pas comme un agent d'inversion de la latence (LRA).

Il a été récemment proposé que l'infection par IN+ HIV-1 puisse générer des provirus qui avaient été réduits au silence épigénétiquement avant l'intégration, puis restés silencieux après l'intégration, générant ainsi des cellules T infectées de manière latente27. Si elle est correcte, l'inhibition du silence de l'ADN du VIH-1 non intégré par SMC5/6 devrait également inhiber la formation de lymphocytes T infectés de manière latente. Pour tester cette hypothèse, nous avons demandé si la perte d'expression de SMC5/6 ou le traitement par TAK-981 à 0 dpi inhiberaient l'établissement d'infections latentes par le VIH-1 dans les cellules T CEM-SS. Le test utilisé28 implique l'infection de cellules WT ou ΔSMC5 CEM-SS avec le virus indicateur IN+ NL-GFPΔEnv en présence ou en l'absence de TAK-981 à un MOI d'environ 0,1. À 3 dpi, les cellules ont été soumises à FACS et des cellules GFP-négatives représentant des cellules non infectées ou infectées de manière latente par le VIH-1 ont été isolées. Les profils FACS ont de nouveau montré un niveau plus élevé de cellules GFP + dans le WT CEM-SS traité avec TAK-981 à 0 dpi et dans le ΔSMC5 CEM-SS quel que soit le traitement TAK-981 (Extended Data Fig. 6a), vraisemblablement à nouveau résultant de la transcription de provirus IN + VIH-1 non intégrés. Les cellules GFP-négatives isolées ont été cultivées pendant 6 jours supplémentaires, puis traitées avec du diluant diméthylsulfoxyde (DMSO) ou avec du TAK-981, de l'acétate de myristate de phorbol (PMA) ou du facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α). Le PMA et le TNF-α sont tous deux de puissants activateurs de l'activité de NF-kB et des LRA efficaces28,29. Un jour plus tard, à 10 dpi, les cellules ont de nouveau été analysées par FACS (une expérience représentative est illustrée à la Fig. 4a et une compilation de trois réplicats biologiques indépendants est illustrée à la Fig. 4b). Il est important de noter que tout l'ADN du VIH-1 non intégré a été perdu des cellules CEM-SS infectées à 7 dpi (données étendues, Fig. 6b), de sorte que toute expression de GFP observée à 10 dpi doit provenir de provirus intégrés.

Les cellules WT ou ΔSMC5 CEM-SS ont été infectées avec IN+ NL-GFPΔEnv ±TAK-981. À 3 dpi, les cellules GFP− ont été isolées par FACS (voir Extended Data Fig. 6a pour les profils FACS pertinents) et les cellules ont ensuite été cultivées pendant 6 jours supplémentaires pour permettre la perte de tout l'ADN du VIH-1 non intégré (Extended Data Fig. 6b) avant d'être traité soit avec du diméthylsulfoxyde de diluant (DMSO), TAK-981 ou les LRA PMA ou TNF-α. Un jour plus tard à 10 dpi, l'expression de la protéine fluorescente verte (GFP) a été analysée par FACS. a, Profils FACS représentatifs. b, Un résumé des données en a montrant la moyenne ± écart-type de 3 répétitions biologiques (****P < 0,0001, ANOVA à 2 voies, test de Tukey). c, l'ADN total du VIH-1 a été quantifié dans les cellules indiquées à 9 dpi avant l'ajout du médicament. Les données sont la moyenne ± écart-type de 3 répétitions biologiques (**** P < 0,0001, ANOVA à 1 facteur, test de Dunnett).

Données source

Dans les cellules WT CEM-SS, PMA et TNF-α ont tous deux induit l'expression de la GFP dans environ 5% des cellules GFP-négatives triées, tandis que le niveau de cellules GFP + dans la culture non induite était d'environ 0, 3% (Fig. 4a, b), une différence hautement significative (P <0, 001). En revanche, le traitement PMA ou TNF-α à 9 dpi n'a pas réussi à induire une expression de GFP supérieure au bruit de fond dans les cellules WT CEM-SS traitées à 0 dpi avec TAK-981, ou dans le clone ΔSMC5 CEM-SS en l'absence ou en présence de traitement TAK-981 à 0 dpi (Fig. 4a, b), même si l'infection initiale de ces cellules, mesurée par l'expression de GFP, était en fait plus élevée que celle observée dans les cellules WT CEM-SS (Extended Données Fig. 6a).

Si la perte de la fonction du complexe SMC5/6 inhibe effectivement l'établissement d'infections latentes par le VIH-1, alors les cellules WT GFP− triées par FACS (Extended Data Fig. 6) devraient contenir plus d'ADN proviral du VIH-1 latent que les cellules GFP− dépourvues de la fonction SMC5/6 au moment de l'infection. En fait, l'analyse qPCR effectuée à 9 dpi avant l'ajout du médicament a démontré que les cellules WT GFP- isolées contenaient en effet significativement (P <0, 001) plus d'ADN du VIH-1 que les cellules GFP- ΔSMC5 ou les cellules WT traitées avec TAK-981 au moment de l'infection (Fig. 4c).

Si le silençage épigénétique de l'ADN du VIH-1 non intégré peut conduire à l'établissement d'infections latentes, alors retarder l'intégration pourrait augmenter le nombre d'infections latentes. Pour tester cette idée, nous avons infecté des cellules WT CEM-SS avec la forme IN+ du virus indicateur NL-GFPΔEnv en présence ou en l'absence de l'inhibiteur de l'intégrase raltégravir. Le médicament a été lavé à 2 dpi et les cellules GFP- isolées par FACS à 5 dpi. Les cellules ont ensuite été traitées avec du diluant, du PMA ou du TNF-α à 11 dpi et analysées par FACS à 12 dpi. Le traitement au raltégravir de 0 à 2 dpi a en effet augmenté le pourcentage de cellules qui exprimaient la GFP après un traitement au PMA ou au TNF-α, même si le nombre de GFP+, c'est-à-dire d'infections productives détectées à 5 dpi, était similaire (Extended Data Fig. 7). Ainsi, prolonger le temps entre la synthèse d'ADN proviral et l'intégration de manière significative (P < 0,001) augmente le nombre de provirus intégrés latents qui peuvent ensuite être activés par un LRA. Ces données démontrent que la latence du VIH-1 peut effectivement être établie avant l'intégration provirale.

Pour examiner si SMC5/6 contribue également à l'établissement de la latence virale dans les cellules primaires, nous avons d'abord confirmé que le TAK-981 pouvait également sauver l'expression génique de l'ADN du VIH-1 non intégré dans les cellules T CD4+ primaires infectées (Fig. 5a). Ensuite, nous avons demandé si le TAK-981 pouvait inhiber l'établissement d'infections latentes par le VIH-1 dans les lymphocytes T CD4+ primaires en utilisant un test de latence du VIH-1 qui utilise un virus rapporteur bicolore30,31. Dans ces virus, la GFP est exprimée sous le contrôle du LTR du VIH-1, qui est réduit au silence dans les infections latentes, tandis que mCherry est exprimé à l'aide du promoteur exogène EF1-α, qui résiste au silençage épigénétique. L'infection des lymphocytes T avec un rapporteur bicolore du VIH-1 génère des cellules GFP+ et mCherry+, représentant des infections productives, et des cellules GFP− mais mCherry+, représentant des infections latentes. Nous avons donc demandé si l'ajout de TAK-981 à 0 dpi mais pas à 6 dpi à des cellules infectées par le virus rapporteur bicolore IN + affecterait le niveau de cellules GFP-mCherry + à 7 dpi, qui est le moment le plus précoce où tout l'ADN non intégré du VIH-1 aurait été perdu (Extended Data Fig. 8a).

a, des lymphocytes T CD4+ isolés du sang ont été infectés avec IN+ ou IN- NL-NLucΔEnv en présence de 150 nM de TAK-981 dans du DMSO ou avec du DMSO seul, à 0 hpi. Les cellules ont été collectées à 48 hpi, lysées et les niveaux de NLuc déterminés. Moyenne ± écart-type de 3 répétitions biologiques (** P = 0,0045, test t non apparié à 2 queues). b, les cellules T CD4 + ont été infectées avec un virus rapporteur bicolore GFP / mCherry défectueux pour la réplication à un faible MOI d'environ 0, 05 en présence de DMSO ou de 150 nM TAK-981 ajouté à l'infection, ou avec 150 nM TAK-981 ou 80 nM PMA ajouté à 6 dpi. Le nombre de cellules exprimant GFP et mCherry a ensuite été déterminé à 7 dpi par FACS. c–e, Données de 5 infections primaires indépendantes de lymphocytes T CD4+ réalisées comme en b montrant le pourcentage de cellules GFP+ mCherry+ (c), GFP− mCherry+ (d) ou GFP− mCherry− (e) à 7 dpi en présence et en l'absence de TAK-981 ajouté à 0 dpi. Des expériences individuelles utilisant les mêmes échantillons de cellules T ± TAK-981 sont liées par des lignes. f, analyse statistique des ratios à partir des données présentées dans c–e à l'aide d'un test t apparié de ratio bilatéral.

Données source

En fait, nous avons observé une réduction constante du nombre de cellules T primaires GFP-mCherry + infectées de manière latente lorsque TAK-981 a été ajouté à 0 dpi (de 2, 11% à 0, 79% sur la Fig. 5b), mais nous n'avons constaté aucun effet significatif sur le niveau de cellules GFP- mCherry + lorsque TAK-981 a été ajouté à 6 dpi, comme prévu (Fig. 5b, voir également Données étendues Fig. 8b). Nous avons constaté une augmentation concomitante du pourcentage de cellules T GFP + mCherry + dans la culture traitée avec TAK-981 à 0 dpi (de 2, 62% à 4, 43%, sur la Fig. 5b), représentant des infections productives. Encore une fois, l'ajout de TAK-981 à 6 dpi n'a eu aucun effet (Fig. 5b, voir également Extended Data Fig. 8b).

Comme le montre la Fig. 5c – e, qui présente des données compilées à partir de cinq réplicats biologiques indépendants utilisant des cellules T CD4 + primaires de cinq donneurs de sang différents, nous avons constaté une augmentation constante du nombre de cellules T GFP + mCherry + (Fig. 5c) et une diminution constante du nombre de cellules GFP− mCherry + (Fig. 5d) dans chaque expérience analysée. Dans l'ensemble, l'ajout de TAK-981 à 0 dpi a augmenté le nombre de cellules GFP + mCherry + infectées de manière productive de 1, 62 ± 0, 024 fois ( P <0, 0001) et a diminué le nombre de cellules GFP- mCherry + infectées de manière latente de 0, 55 ± 0, 115 fois ( P = 0, 007) (Fig. 5f). L'augmentation des cellules GFP + mCherry + provenait non seulement de la population GFP- mCherry + mais également de la population GFP- mCherry-, qui a diminué modestement mais significativement dans la culture traitée avec TAK-981 à 0 dpi (Fig. 5e, f, rapport global 0, 98 ± 0, 006, P = 0, 047). Par conséquent, le traitement TAK-981 à 0 dpi inhibe également la génération de cellules dans lesquelles les promoteurs LTR et EF1-α sont silencieux épigénétiquement.

Ici, nous montrons que le complexe SMC5/6 humain induit la SUMOylation de l'ADN du VIH-1 non intégré chromatinisé conduisant à son silençage épigénétique. En conséquence, la perte d'expression de SMC5/6, ou l'inhibition de la SUMOylation de la chromatine à l'aide de l'inhibiteur TAK-981, sauve l'expression génique de l'ADN du VIH-1 non intégré et permet même à l'IN-VIH-1 d'établir une propagation de l'infection dans les cellules T en culture (Fig. 1). Étonnamment, nous démontrons également que la perte d'expression de SMC5/6, ou le traitement par TAK-981, inhibe nettement l'établissement de la latence du VIH-1 à la fois dans la lignée cellulaire T CEM-SS et dans les cellules T CD4+ primaires (Figs. 4 et 5).

Bien que les thérapies antirétrovirales puissent réduire la charge virale chez les patients atteints du SIDA en dessous du niveau de détection, ces médicaments ne guérissent pas le VIH-1. Cela est dû à la présence continue d'un petit nombre de cellules T infectées de manière latente qui contiennent des provirus VIH-1 intacts intégrés qui sont transcriptionnellement inertes mais peuvent être activés par des stimuli externes pour relancer la réplication virale32. Bien que des efforts considérables aient été déployés pour essayer de développer des LRA capables d'activer le VIH-1 latent et, en présence de thérapies antirétrovirales, d'éliminer le corps du virus infectieux, ces efforts n'ont jusqu'à présent pas permis d'identifier des LRA à la fois efficaces et non toxiques.

Le réservoir latent a été attribué aux lymphocytes T activés qui sont infectés par le VIH-1 coïncidant avec leur réversion en lymphocytes T mémoire au repos32. Cependant, la latence du VIH-1 peut être établie à la fois dans les lignées cellulaires T CD4 et les cellules T activées in vitro28,31, et la majeure partie du réservoir latent chez les patients sous thérapie antirétrovirale est maintenue par expansion clonale33,34,35,36, avec de nombreuses cellules latentes exprimant les marqueurs de prolifération HLA-DR37,38, CD2539 et CD6940. Ainsi, la répression de l'expression du gène du VIH-1 en latence n'est pas simplement le résultat de l'état de repos des lymphocytes T mémoire au repos. Il a également été proposé que la latence résulte de l'intégration des provirus du VIH-1 dans des régions d'hétérochromatine, entraînant un silençage épigénétique41. Pourtant, l'analyse des sites d'intégration latents individuels du VIH-1 chez les patients a montré que la plupart des provirus VIH-1 intacts de pleine longueur sont intégrés dans des gènes activement transcrits42,43,44,45,46. Dans l'ensemble, le ou les mécanismes sous-jacents à l'établissement de la latence du VIH-1 sont restés insaisissables et les facteurs cellulaires qui favorisent la latence virale sont largement indéfinis.

Nos données suggèrent que le mécanisme clé sous-jacent à l'initiation de la latence du VIH-1 est le silençage épigénétique par SMC5/6 des provirus non intégrés qui conservent leurs modifications épigénétiques inhibitrices préexistantes après l'intégration. Ces données identifient le complexe SMC5/6 comme étant directement impliqué dans la promotion de l'établissement de la latence du VIH-1 et suggèrent que la latence ne résulte pas de propriétés intrinsèques du rétrovirus entrant, mais plutôt d'un effet secondaire malheureux d'une réponse immunitaire innée cellulaire qui a probablement évolué pour faire taire l'ADN étranger invasif.

Les cellules humaines 293T (femelles) ont été initialement achetées auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC) et ont été cultivées dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, Sigma) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS, Hyclone) et d'un antibiotique-antimycotique (Gibco).

Des cellules CEM-SS humaines (femelles) ont été obtenues à partir du réactif NIH AIDS et ont été cultivées dans du milieu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) additionné de 10 % de FBS et d'un antibiotique-antimycotique.

Des cellules CEM-SS exprimant de manière stable la protéine Cas9 ont été produites à l'aide d'un plasmide pLentiCrispr v2-Blast modifié qui était un cadeau de Mohan Babu (plasmide Addgene 83480). Le promoteur U6, l'échafaudage sgRNA et le promoteur EF1-α ont été excisés de pLentiCrispr v2-Blast par clivage avec KpnI et AgeI et remplacés par un promoteur SFFV. Des lentivirus ont été fabriqués à partir de cette construction en transfectant 5 × 106 cellules 293T dans une boîte de 15 cm avec 15 µg du vecteur lentiviral, ainsi que 10 µg et 5 µg des plasmides d'emballage pCMVR8.74 et pMD2.G, respectivement, en utilisant de la polyéthylèneimine (PEI). Les milieux ont été changés 24 h après la transfection (hpt). Les surnageants contenant des particules lentivirales ont été collectés à 72 hpt, filtrés à travers un filtre de 0,44 µm et passés à travers un concentrateur de 100 000 MWCO (Amicon). Après concentration, 5 × 106 cellules CEM-SS ont été incubées avec 2 ml du surnageant concentré à 37 ° C pendant une nuit. Les milieux ont ensuite été remplacés par du milieu RPMI frais et les cellules incubées pendant 48 h. À ce stade, les milieux ont été remplacés par du milieu RPMI frais additionné de 20 µg ml-1 de blasticidine (Santa Cruz) pour permettre la sélection des cellules transduites. Les cellules ont ensuite été clonées en cellule unique en aliquotant une dilution limitée dans des plaques à 96 puits de sorte que chaque puits ait environ 10 % de chances de contenir une cellule. Ces cellules clonées ont ensuite été analysées pour l'activité Cas9.

Le sang humain provenant de donneurs sains a été acheté auprès du Gulf Coast Regional Blood Center. Tous les donneurs ont été testés négatifs pour le VIH-1 et le VIH-2. Les échantillons ont été anonymisés avant l'achat. Les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) ont été isolées du sang total par centrifugation en gradient de densité sur Histopaque (Sigma) et les cellules CD4 + isolées à l'aide d'un kit d'isolement CD4 + (Invitrogen). Les cellules CD4+ isolées ont été activées par incubation avec des anticorps contre CD28/CD49d (BD Biosciences) et 5 µg ml-1 de phytohémagglutinine (PHA) dans du RPMI additionné de 10 % de FBS et d'IL-2 comme décrit précédemment47. Les cellules ont été maintenues à 105–106 cellules par ml en présence d'IL-2, d'anticorps CD28/CD49d et de PHA pendant 1 semaine avant l'infection par le VIH-1.

Un virus rapporteur de la nano luciférase du VIH-1 (NL-NLuc) a été généré à partir du virus parental NL4-3 en remplaçant le gène viral nef dans NL4-3 par le gène indicateur NLuc48. NL-NLucΔEnv a été fabriqué à partir de NL-NLuc par élimination d'un segment de 943 pb du gène env qui le rend incompétent pour la réplication. De même, le virus rapporteur GFP (NL-GFPΔEnv) a été généré à partir de NL-NLucΔEnv en remplaçant GFP à la place de nef. Le virus rapporteur NL-DC exprime eGFP sous le contrôle du LTR du VIH-1 et de mCherry à partir d'un promoteur EF1-α interne et a été généré en clonant une cassette EF1-α: mCherry dans le site XhoI situé en 3 'de GFP dans NL-GFPΔEnv. Tous ces virus rapporteurs ont un gène vpr intact.

Un virus rapporteur GFP, IN-NL-GFPΔVpr, dépourvu de protéine Vpr fonctionnelle, a été créé à partir du virus parental IN-NL-GFP en insérant une duplication TTAA à 15 pb en 3' du codon stop Vif. Cela introduit un codon stop et une mutation de décalage de cadre au début du cadre de lecture ouvert de Vpr qui crée une protéine Vpr tronquée non fonctionnelle49. Ces virus ont soit l'intégrase WT (IN+), soit la mutation D64V (IN-) qui bloque la fonction IN.

Les plasmides exprimant le provirus NL-NLuc compétent pour la réplication ont été transfectés dans des cellules 293T à l'aide de PEI. Les provirus NL-NLucΔEnv et NL-GFPΔEnv non propagés ont été co-transfectés dans des cellules 293T avec le plasmide pMD2.G codant pour la protéine VSV-G. Après 24 h, les milieux usés ont été remplacés par des milieux frais. À 72 hpt, les milieux surnageants ont été filtrés à travers un filtre de 0,44 μm. Les milieux surnageants contenant WT ou IN− HIV-1 ont été normalisés par les niveaux de p24, mesurés par ELISA, avant d'être utilisés pour infecter les cellules cibles. Le rapport de volume normalisé MOI: p24 a été évalué en infectant 106 cellules CEM-SS avec IN + NL-GFPΔEnv ou une lignée cellulaire Tax inductible CEM-SS (exprimant une protéine Tax HTLV-1 connue pour activer l'expression génique du VIH-110 non intégré) avec IN- NL-GFPΔEnv. Ces cellules ont été infectées avec différentes dilutions du virus, puis analysées par cytométrie en flux à 2 dpi (stratégie de déclenchement décrite dans Extended Data Fig. 9). Le nombre de cellules GFP+ à chaque dilution a ensuite été converti en MOI en utilisant la formule MOI = -ln (1- proportion de cellules GFP+) qui a ensuite été corrélée au niveau de p24 dans le stock viral. Ainsi, la quantité de virus IN- utilisée (par million de cellules) pour chaque MOI a pu être déterminée.

La banque de knock-out CRISPR humain Brunello (Addgene 73178)15 a été utilisée pour transformer des cellules électrocompétentes (Endura). De la bibliothèque (remise en suspension dans l'eau), 500 ng ont été utilisés pour transformer un total de 4 × 25 μl de cellules dans une cuvette de 1 mm (10 μF, 600 Ω, 1,8 kV) pour produire> 108 colonies lorsqu'elles sont plaquées pour s'assurer que chaque sgRNA dans la bibliothèque était couvert ~ 1 000 × en moyenne. Ces colonies ont été collectées et les plasmides de la bibliothèque regroupés extraits en utilisant des colonnes Maxiprep (Zymo).

Des bibliothèques lentivirales ont été créées en transfectant des cellules 293T avec l'ADN de la bibliothèque et les plasmides d'encapsidation pCMVR8.74 et pMD2.G en utilisant du PEI. Les milieux ont été changés à 24 hpt, et le surnageant contenant la banque de lentivirus a été collecté et filtré à travers un filtre de 0,44 µm à 72 hpt. Le lentivirus a été titré et utilisé pour transduire des cellules CEM-SS Cas9 qui ont ensuite été soumises à des courbes de destruction de puromycine (Gemini) à 2 dpt pour déterminer la quantité de lentivirus corrélée à un MOI de 0,3. Cette quantité a ensuite été utilisée pour transduire 108 cellules CEM-SS Cas9 à 0,3 MOI, et les cellules ont été sélectionnées dans 1 µg ml-1 de puromycine à 2 dpt pendant une semaine.

Les cellules knock-out regroupées ont ensuite été infectées pendant 2 jours avec un virus rapporteur IN- HIV-1 NL-GFP qui a une substitution d'acide aminé D64V inactivante dans le gène de l'intégrase. Ces cellules infectées ont ensuite été passées dans un FACS Aria II (BD Biosciences) contenant du BSL-3 pour collecter la population de cellules GFP + à partir de laquelle l'ADN génomique a été extrait. L'ADNg purifié a été incubé avec l'enzyme de restriction DpnI pour éliminer toute contamination plasmidique résiduelle.

Le sgRNA de cet ADN a été amplifié par PCR à l'aide d'amorces flanquantes (FP : 5′-TGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGA -3′ RP : 5′-GGCTCGAGGGGGCCCGGGTGCAAAGATGGATA -3′) puis recloné dans le plasmide parental pLentiGuide Puro via les sites de restriction NdeI et XmaI. Des cycles ultérieurs de transformation, de production de lentivirus, de transduction et d'infection ont été effectués comme décrit pour un total de 3 cycles. Lors du tour final, l'ADN a été amplifié à l'aide des amorces de séquençage Illumina indexées, purifié dans une colonne de purification PCR (Zymo) et séquencé sur le NovaSeq 6000.

Les données de séquençage ont été analysées à l'aide de MAGECK-VISPR50 en générant d'abord des nombres de lectures d'ARNsg en invoquant le «compte de mageck», en analysant l'enrichissement en ARNsg et en obtenant des classements de gènes à l'aide de l'algorithme Robust Rank Aggregation sur des nombres de lectures normalisés. Le « test de Mageck » a été exécuté avec les paramètres « –remove-zero both–remove-zero-threshold 0 » comme suggéré précédemment51.

Des cellules knock-out à gène unique ont été générées par transduction de cellules CEM-SS Cas9 avec des lentivirus fabriqués à partir d'un plasmide pLentiGuide-Puro (Addgene 52963)52 exprimant l'ARNg d'intérêt. Les cellules transduites ont été sélectionnées à 2 jours avec 1 µg ml-1 de puromycine pendant 1 semaine. Des expériences d'infection sur des cellules polyclonales knock-out ont été réalisées en infectant des cellules à ce stade.

Les cellules clonales ont été isolées en aliquotant les cellules résistantes à la puromycine à une dilution limite dans une plaque à 96 puits, puis en les isolant et en les développant. Les cellules knock-out ont ensuite été identifiées et validées par séquençage clonal des lésions génétiques et par western blot.

Les cellules ont été collectées et lysées dans du tampon Laemmli, soniquées et dénaturées à 95°C pendant 15 min. Les lysats ont été soumis à une électrophorèse sur des gels de SDS-polyacrylamide 4–20 % (Bio-Rad), transférés sur des membranes de nitrocellulose puis bloqués dans du lait 5 % dans du PBS + 0,1 % Tween. Les membranes ont été incubées dans des anticorps primaires et secondaires dilués dans du lait à 5 % dans du PBS + 0,1 % de Tween pendant 2 h chacune, puis lavées dans du PBS + 0,1 % de Tween. Les membranes ont été incubées avec un substrat chimiluminescent amélioré à base de luminol et les signaux ont été visualisés à l'aide de GeneSnap (Syngene). Les membranes ont été immunotransférées avec des anticorps spécifiques pour sonder SMC5 (Research Resource Identifier RRID:AB_2900565), SMC6 (RRID:AB_2747157), NSMCE2 (RRID:AB_10637854), NSMCE4A (RRID:AB_11169701), SLF1 (RRID:AB_10816722), SLF2 (RRID:AB_1112 9755), FLAG (RRID:AB_259529) ou actine (RRID:AB_2687938). Les anticorps primaires ont été utilisés à une dilution de 1:1 000, à l'exception de l'anticorps d'actine qui a été utilisé à 1:5 000. Des anticorps secondaires anti-souris (RRID:AB258431) ou anti-lapin (RRID:AB_258284) conjugués à la HRP ont été utilisés à une dilution de 1:5 000.

Les cellules ont été collectées, lavées dans du PBS et fixées dans du paraformaldéhyde à 1% dans du PBS pendant 10 min avant d'être remises en suspension dans de l'albumine de sérum bovin (BSA) à 2% dans du PBS et passées à travers un tamis cellulaire. Les cellules ont été passées dans un cytomètre en flux Fortessa X20 (BD Biosciences) et les données ont été analysées à l'aide de FlowJo v10.6.2.

Les cellules ont été collectées, lavées trois fois dans du PBS, lysées dans un tampon de lyse passive (Promega) et testées pour l'activité NLuc en utilisant le test Nano-Glo luciférase sur un luminomètre Lumat LB9507 (Bertold Technologies).

Des cellules (107) de la lignée cellulaire parentale Cas9, ou des lignées cellulaires ΔSMC5 et ΔSLF2, ont été infectées avec le virus WT ou IN-NL-NLuc dans un total de 20 ml de RPMI. Les stocks viraux ont été prétraités avec 5 U ml-1 DNase I pour éliminer l'ADN plasmidique résiduel, et toutes les infections IN- ont été réalisées en présence de 20 µM de raltégravir pour prévenir les mutations révertantes. Les cellules ont été comptées aux jours 1, 2, 3, 5, 7, 10, 12, 14 et 16 dpi lorsque cela était possible, et les milieux ont été périodiquement rafraîchis pour maintenir le nombre de cellules en dessous de 106 cellules par ml. Des cellules vivantes (106) ont été collectées à chaque instant (si possible) et réparties de manière égale pour doser NLuc et pour l'extraction d'ADN et d'ARN.

Pour l'analyse de l'ADN, les cellules ont été culottées et lavées trois fois dans du PBS glacé. L'ADN a ensuite été extrait à l'aide de colonnes DNA Miniprep Plus (Zymo) selon les instructions du fabricant, puis incubé avec DpnI (NEB) pour éliminer toute contamination plasmidique résiduelle.

Pour l'analyse de l'ARN, les cellules ont été lysées dans du TRIzol (Thermo Fisher) pour recueillir l'ARN, et la DNAse I a été traitée pour éliminer la contamination résiduelle de l'ADN. L'ARN a ensuite été converti en ADN complémentaire à l'aide du kit High Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems).

La quantification de l'ADN et de l'ARN totaux du VIH-1 a été réalisée sur un appareil qPCR en temps réel QuantStudio 6 Pro (Thermo Fisher) à l'aide d'une sonde TaqMan totale personnalisée du VIH-1 qui amplifie la région U5-gag sur le VIH-1.

Pour la qPCR nichée en temps réel Alu-LTR, l'ADN a été amplifié à l'aide d'une approche de PCR nichée18. En bref, une première PCR non saturante utilisant les amorces ALU1 (5′-TCCCAGCTACTGGGGGAGGCTGAGG-3′), ALU2 (5′-GCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACA-3′) et L-HIV (5′-ATGCCACGTAAGCGAAACTTAAGCCTCAATAAAGCTTGC-3′) a été réalisée en utilisant de l'ADN isolé à partir de cellules infectées par le VIH-1. Une fois les produits de PCR purifiés à l'aide d'un kit PCR Kleen (Bio-Rad), une qPCR nichée a été réalisée à l'aide des amorces AA55M (5′- GCTAGAGATTTTCCACACTGACTAA-3′) et L (5′- ATGCCACGTAAGCGAAAC-3′) et du mélange maître vert SYBR (Thermo Fisher).

Les quantités d'ADN circulaire non intégré du VIH-1 2LTR ont été quantifiées par qPCR à l'aide d'amorces/sondes TaqMan qui amplifient à travers la jonction U5-U3 uniquement présentes dans les cercles 2LTR (FP : 5′- AACTAGGGAACCCACTGCTTAAG -3′, RP : 5′- TCCACAGATCAAGGATATCTTGTC -3′, sonde : 5′- FAM- ACACTACTTG AAGCACTCAAGGCAAGCTTT-TAMRA-3′)53.

La quantification relative à l'aide de la méthode ΔΔCT avec la β-actine comme contrôle interne a ensuite été réalisée à l'aide d'une sonde génomique de β-actine (ADN) ou de β-actine (ARN) épissée. Une quantification relative par la méthode ΔΔCT54 avec la β-Actine comme contrôle interne a ensuite été réalisée.

Les cellules indiquées ont été cultivées à 106 cellules par ml dans du RPMI et infectées avec IN-NL-GFP. Les stocks viraux ont été pré-incubés avec 5 U ml-1 DNase I pour éliminer la contamination plasmidique avant l'infection.

Les cellules ont été collectées aux moments indiqués après l'infection, rincées deux fois avec du PBS et réticulées avec du formaldéhyde à 1% pendant 15 min à 25 ° C avant d'être trempées dans de la glycine 0, 125 M pendant 5 min. Les cellules rincées ont ensuite été lysées dans un tampon de lyse ChIP (Tris-HCl 50 mM pH 8, 0, dodécylsulfate de sodium 1%, EDTA 10 mM) et soniquées sur glace avec un Fisher Sonic Dismembrator 60 (sortie 4, 5, impulsion de 20 s répétée 6 fois sur glace avec 40 s entre chaque sonication). Le surnageant contenant de la chromatine soniquée a été pré-clarifié par l'ajout de billes magnétiques de protéine G (Thermo Fisher) qui avaient été prétraitées avec de l'ADN de sperme de saumon dénaturé (Invitrogen). Les billes magnétiques ont été retirées et la chromatine soniquée a été incubée pendant une nuit à 4 ° C en utilisant 2, 5 µg de l'anticorps indiqué dans un tampon de dilution ChIP (16, 7 mM Tris-HCL pH 8, 0, 1% Triton X-100, 0, 01% SDS, 150 mM NaCl, 1, 2 mM EDTA). La chromatine soniquée (5%) a été stockée comme ADN d'entrée sans autre traitement jusqu'à l'étape de réticulation inverse.

Des billes de protéine G ont ensuite été ajoutées au mélange chromatine-anticorps, incubées pendant 2 h à 4 °C, puis lavées 3 fois avec du tampon ChIP LiCl (10 mM Tris-HCL pH 8,0, 1 % NP-40, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 1 % désoxycholate de Na) et deux fois avec du tampon TE (10 mM Tris-HCL pH 8,0, 1 mM EDTA). Les complexes protéine-ADN ont été élués des billes avec un tampon d'élution (0,1 M NaHCO3, 1% SDS), dé-réticulés par incubation à 65 ° C pendant 16 h et à 95 ° C pendant 15 min, puis digérés en ajoutant 50 μg de protéinase K et en incubant à 50 ° C pendant 3 h. L'ADN a été extrait à l'aide d'un kit DNA Miniprep Plus (Zymo), digéré avec DpnI (NEB) pour éliminer toute contamination plasmidique, puis utilisé pour l'analyse qPCR à l'aide d'amorces qui amplifient U5-R sur le promoteur du VIH-1 (FP : 5′- CTCTCTGGTTAGACCAGATC-3′, RP : 5′-GCTAGAGATTTTCCACACTG-3′). Les données de la puce sont exprimées en pourcentage de l'ADN d'entrée.

Un vecteur lentiviral exprimant une protéine NSMCE2 marquée FLAG qui résiste à la coupure par le sgRNA exprimé dans les cellules knock-out CEM-SS ΔNSMCE2 a été créé en mutant la séquence NSMCE2 à partir d'un plasmide d'expression (OHu31586, GenScript) via une PCR d'extension de chevauchement pour introduire des mutations TC et CT synonymes dans la séquence cible du sgRNA (GTATCAACTCTGGTATGGAC en GcATtAACTCTGGTATGGAC). Ce produit de PCR mutant FLAG-NSMCE2 a ensuite été cloné dans le vecteur lentiviral pLCE en utilisant les sites de restriction Nhel et Xhol.

De même, le mutant NSMCE2ΔSUMO a été créé à l'aide d'une PCR d'extension de chevauchement pour introduire les substitutions d'acides aminés C185S et H187Q dans le domaine RING nécessaire à la fonction E3 SUMO ligase25.

Des lentivirus ont été créés à partir de pLCE (témoin), pLCE FLAG-NSMCE2 et pLCE FLAG-NSMCE2ΔSUMO, qui ont ensuite été utilisés pour transduire des cellules CEM-SS ou CEM-SS ΔNSMCE2. Ces cellules ont été infectées avec IN+/IN− NL-NLuc ou IN− NL-GFP à 0,3 MOI et les cellules ont été collectées à 2 dpi pour les tests NLuc respectifs (NL-NLuc), ou pour la cytométrie en flux et ChIP–qPCR (NL-GFP). L'expression de ces constructions NSMCE2 a été validée par western blot.

TAK-981 (MedChemExpress) est un inhibiteur global de la SUMOylation26 et a été reconstitué dans du DMSO en un stock de 5 mM. TAK-981 a été ajouté aux cellules CEM-SS Cas9 et ΔSMC5 infectées par NL-NLuc à des concentrations de 0, 5, 15, 30, 75, 150, 500 et 1 000 nM, et les cellules ont été collectées pour un test NLuc après 2 dpi.

Pour tester les effets de TAK-981 sur l'expression de l'ARN viral dans les cellules infectées, des cellules CEM-SS ont été infectées avec IN+/IN- NL-NLuc en présence ou en l'absence de 150 nM de TAK-981. L'ARN a été extrait à 2 dpi avec du TRIzol (Thermo Fisher) et de la DNAse I traitée pendant 2 h. L'ADNc a ensuite été fabriqué à l'aide du kit High Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems). Les niveaux d'ARN non épissé gag du VIH-1 ou d'ARN viral épissé du donneur 1 accepteur 1 (A1D1) et du donneur épissé 7 accepteur 4 (A4D7) ont été quantifiés par qPCR en utilisant les amorces pour gag (FP : 5′-GCGAGAGCGTCGGTATTAAGCG-3′, RP : 5′-AATCGTTCTAGCTCCCTGCTTGC-3′), A1D1 ( FP : 5′-GATCTCTCGACGCAGGACTC-3′, RP : 5′-TGGTCCTTTCCAAACTGGAT-3′) et A4D7 (FP : 5′- CAAGCTTCTCTATCAAAGCAACC -3′, RP : 5'- AATCGAATGGATCTGTCTCTGTC -3′)55.

Pour comprendre la cinétique d'inhibition de la SUMOylation sur l'expression des gènes viraux et les modifications épigénétiques dans les cellules infectées, 150 nM de TAK-981 ont été ajoutés aux cellules CEM-SS Cas9 et ΔSMC5 au moment de l'infection, ou à 16, 19, 21, 24, 36 et 48 hpi. Les cellules ont été infectées avec NL-NLuc Δenv et collectées à 72 hpi pour des tests NLuc ou ChIP-qPCR en utilisant des anticorps anti-SUMO2/3, H3Ac ou H3K9me3 et en quantifiant le promoteur du VIH-1 à l'aide d'amorces qui amplifient la région U5-R (FP : 5'- CTCTCTGGTTAGACCAGATC-3′, RP : 5'-GCTAGAGATTTTCCACACTG-3′ ). Les données de la puce sont exprimées en pourcentage de l'ADN d'entrée.

Des cellules WT ou ΔSMC5 CEM-SS ont été infectées par le virus IN + NL-GFPΔEnv à un MOI d'environ 0, 1 en présence ou en l'absence de 150 nM de TAK-981. La névirapine a été ajoutée aux cellules à 2 dpi pour inhiber tout événement d'infection tardive, et à 3 dpi, les cellules ont été lavées et remises en suspension dans 2% de BSA dans du PBS pour le tri sur un BSL-3 contenant FACS Aria II (BD Biosciences) pour isoler les cellules GFP−. Ces cellules ont été autorisées à récupérer dans un milieu de croissance pendant 6 jours (9 dpi) avant traitement avec du DMSO, 150 nM TAK-981, 80 nM PMA ou 1 ng ml-1 TNF-α. Les cellules ont été collectées le lendemain (10 dpi) pour analyser l'expression de la GFP par cytométrie en flux.

Des cellules WT ou ΔSMC5 CEM-SS ont été infectées par le virus IN+ NL-GFPΔEnv en présence ou non de raltégravir 500 nM. À 2 dpi, toutes les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS, replaquées dans du RPMI avec de la névirapine et cultivées pendant 3 jours supplémentaires. À 5 dpi, les cellules GFP- ont été triées, laissées récupérer dans un milieu de croissance pendant 6 jours, traitées avec du DMSO, du PMA ou du TNF-α (11 dpi) et analysées par cytométrie en flux le lendemain (12 dpi).

Les cellules témoins CEM-SS et ΔSMC5 ont été infectées avec une quantité de p24 normalisée préalablement titrée pour donner 10% de cellules GFP + dans des cellules CEM-SS + Ral (~ 0, 45 MOI) et -Ral (0, 1 MOI) à 5 dpi.

Les lymphocytes T primaires activés isolés des PBMC ont été infectés à un faible MOI d'environ 0, 05 avec un virus rapporteur IN + NL-DC qui exprime l'eGFP du LTR du VIH-1 et mCherry à partir d'un promoteur EF1-α interne. Les infections ont été réalisées en présence et en l'absence de 150 nM de TAK-981 ajouté au moment de l'infection, ou avec 80 nM de PMA connu pour inverser le silençage épigénétique du VIH-1 dans les cellules latentes56 ou 150 nM de TAK-981 ajouté 24 h avant le prélèvement. Les cellules ont été collectées pour la cytométrie en flux à 7 dpi dans 2% de BSA dans du PBS pour mesurer la fluorescence eGFP et mCherry. La population de lymphocytes T CD4 + a été séparée des cellules mortes et des débris cellulaires par déclenchement sur des analyses de diffusion directe et latérale. L'enrichissement élevé par le kit d'isolement positif CD4 (Invitrogen) nous a également permis d'identifier la population de lymphocytes T CD4+ enrichie et le déclenchement a été effectué pour exclure les quelques monocytes CD4+ possibles qui pourraient être présents. Les données de cytométrie en flux ont ensuite été analysées à l'aide de FlowJo v10.6.2.

L'ADN a également été extrait de ces cellules à 2, 3, 5 et 7 dpi, incubé avec DpnI pour éliminer les contaminants plasmidiques résiduels du VIH-1, puis les quantités d'ADN circulaire non intégré du VIH-1 2LTR quantifiées par qPCR comme décrit dans une section précédente.

La taille de l'échantillon et les valeurs P sont indiquées dans le texte ou les légendes des figures. Les barres d'erreur dans les expériences représentent les écarts-types de la moyenne des expériences indépendantes. Des analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de GraphPad Prism ou rapportées par les outils de calcul indiqués utilisés dans l'analyse de l'écran knock-out CRISPR. Les informations sur les méthodes statistiques sont précisées dans les légendes des figures.

Tous les matériaux uniques générés dans cette étude seront mis à disposition sur demande raisonnable au contact principal et seront également mis à disposition via le programme NIH AIDS Reagent.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles sur demande auprès de l'auteur correspondant. Les données de séquençage générées dans cette étude sont disponibles dans les archives de lecture de séquences NCBI avec l'identifiant d'ensemble de données SRR18245559 (CRISPR Knockout Screen). Les données sources sont fournies avec ce document.

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Cette recherche a été soutenue par la subvention NIH R21-AI157616 au BRC et a reçu le soutien de l'infrastructure du Duke CFAR (P30-AI064518).

Département de génétique moléculaire et de microbiologie, Duke University Medical Center, Durham, Caroline du Nord, États-Unis

Ishak D. Irwan, Hal P. Bogerd et Bryan R. Cullen

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BRC a conçu le projet. IDI et BRC ont conçu les expériences. IDI et HPB ont réalisé les expériences. IDI et BRC ont analysé les données. IDI et BRC ont rédigé le manuscrit avec la contribution de HPB

Correspondance à Bryan R. Cullen.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Microbiology remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

( ab ) Populations polyclonales de cellules CEM-SS Cas9 transduites avec 2 ARNg différents spécifiques des gènes indiqués, puis infectées par ( A ) IN- NL-GFPΔ Env et ( B ) IN- NL-NLuc Δ Env virus rapporteur. %GFP + cellules en A ont été déterminées par cytométrie en flux à 2dpi. L'expression de NLuc dans B a été normalisée par rapport aux cellules CEM-SS Cas9 transduites avec un sgRNA brouillé, qui a été réglé sur 1,0. Les données présentées dans le panneau B représentent la moyenne de trois répétitions biologiques avec SD indiqué.

Données source

Chacune des lignées cellulaires knock-out clonales indiquées a été lysée puis soumise à une analyse Western blot en utilisant des anticorps commerciaux spécifiques du composant complexe SMC5/6 indiqué. L'actine a été utilisée comme contrôle de chargement. Les transferts représentatifs présentés ici indiquent au moins 3 répétitions biologiques.

Données source

( a ) Courbes de croissance sur 7 jours pour les cellules CEM-SS Cas9 non infectées ou les clones ∆SMC5 et ∆SLF2 CEM-SS, en comptant le nombre total de cellules vivantes en culture. (b, c) Les lignées cellulaires indiquées ont été infectées par IN + / IN- HIV-1 et les niveaux d'ADN 2LTR non intégré (B) et (c) d'ADN HIV-1 intégré ont été quantifiés respectivement par qPCR et Alu-qPCR. Les niveaux d'ADN ont été normalisés par rapport aux cellules CEM-SS Cas9 infectées par IN + VIH-1 à 1 dpi, qui a été fixé à 1. Les données présentées représentent la moyenne de trois réplicats biologiques avec SD indiqué. ( d ) Les lignées cellulaires clonales knock-out CEM-SS indiquées ont été infectées par IN + ou IN- NL-NLucΔEnv et l'expression virale de NLuc puis dosée à 2 dpi. Les niveaux de NLuc sont donnés par rapport aux cellules WT CEM-SS Cas9 infectées par IN-NL-NLucΔEnv (contrôle), qui a été fixé à 1,0. Moyenne de trois répétitions biologiques avec SD indiqué. Les données ont été analysées à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle, du test LSD de Fisher (valeurs de p indiquées sur le graphique, ****p < 0,0001).

Données source

Les lignées cellulaires indiquées ont été infectées par IN + et IN-NL-GFP et soumises à ChIP – qPCR à 2 dpi pour quantifier les niveaux des modifications d'histone activatrices H3Ac et H3K4me3 et des modifications répressives H3K9me3 et H3K27me3 liées à l'ADN viral LTR. (a) H3Ac et (b) H3K4me3 (c) H3K9me3, (d) histone totale H3 et (e) H3K27me3. Moyenne de trois répétitions biologiques avec SD indiqué. Les données ont été analysées avec ANOVA à 2 voies, test de Sidak (****p < 0,0001 ; IN- H3K4me3 ΔSMC5 : ***p = 0,0009 ; IN- H3K4me3 ΔSLF2 : ***p = 0,0007).

Données source

Les cellules CEM-SS Control et ΔSMC5 ont été infectées avec des quantités égales de versions Vpr + et Vpr du virus indicateur IN-NL-GFPΔEnv, telles que mesurées par ELISA, et l'expression de la GFP a été analysée par cytométrie en flux à 3 dpi. (a) Profils de fluorescence d'une expérience représentative. (b) Quantification des moyennes de 3 répétitions biologiques indépendantes avec SD indiqué.

Données source

( a ) Des cellules WT ou ΔSMC5 CEM-SS ont été infectées avec VSV-G pseudotypé IN + NL-GFPΔEnv en présence ou en l'absence de TAK-981 à un MOI d'environ 0, 1. Les cellules ont été triées par FACS à 3dpi et les cellules GFP (fenêtrées en rouge) récoltées pour les expériences rapportées sur la figure 4a. ( b ) Le niveau d'ADN 2LTR du VIH-1 non intégré a été quantifié par qPCR dans des cellules CEM-SS infectées par le VIH-1 WT jusqu'à 7 dpi, lorsqu'il a diminué aux niveaux de fond. Moyenne de 3 répétitions biologiques avec SD indiqué. Les données ont été normalisées au signal à 2 dpi, qui a été réglé sur 1,0.

Données source

Des cellules WT ou ΔSMC5 CEM-SS ont été infectées avec IN + NL-GFPΔEnv en présence et en l'absence de l'inhibiteur de l'intégrase raltégravir. Ces cellules ont été infectées à une multiplicité d'infection (MOI) telle que les cellules GFP + dans le + ral et -ral étaient à peu près identiques lorsqu'elles étaient triées à 5 dpi, comme indiqué dans le panneau A. À 2 dpi, les cellules ont été lavées pour éliminer le raltégravir et replaquées pour permettre l'intégration. Les cellules GFP- ont été isolées par FACS à 5 dpi et cultivées pendant 6 jours supplémentaires (11 dpi) où elles ont été traitées avec un diluant (DMSO), TAK-981, PMA ou TNF-α. Les cellules ont ensuite été analysées par cytométrie en flux à 12 dpi pour l'expression de la GFP. ( a ) Profils d'expression GFP représentatifs d'une seule expérience. (b) Compilation de 3 répétitions biologiques indépendantes, montrant les moyens et avec SD indiqué. Données analysées par ANOVA à 2 voies, test de Tukey (****p < 0,0001).

Données source

( a ) Dans les lymphocytes T CD4 + primaires infectés par le VIH-1 WT, l'ADN du VIH-1 non intégré culmine à 2 dpi et diminue à des niveaux de fond de 7 dpi, tel que mesuré par l'analyse qPCR de l'ADN viral circulaire 2LTR. Ces données représentent la moyenne de cinq réplicats biologiques utilisant des lymphocytes T CD4 + obtenus à partir de cinq donneurs de sang distincts, avec SD indiqué. Les données ont été normalisées au signal détecté à 2 dpi, qui a été fixé à 1,0. ( b ) Analyse statistique des sous-populations GFP / mCherry indiquées dans des cellules infectées par le virus indicateur bicolore du VIH-1 et traitées avec 150 nM TAK-981 à 6 dpi contre diluant (DMSO) à 0 dpi. Les cellules infectées ont été récoltées à 7dpi et analysées par FACS. Statistiques calculées avec un test t apparié de rapport bilatéral.

Données source

Les lymphocytes T vivants ont été contrôlés sur un diagramme de dispersion vers l'avant ou sur le côté en fonction de leur taille et de leur granularité. Les cellules individuelles ont été contrôlées sur une hauteur de diffusion vers l'avant par rapport à la zone de diffusion vers l'avant pour éliminer les doublets. Les portes pour les cellules GFP + et/ou GFP- sont définies en fonction des contrôles non infectés et sont évidentes dans les chiffres finaux.

Information supplémentaire.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Western blots non traités.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Western blots non traités.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

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Irwan, ID, Bogerd, HP & Cullen, BR Le silençage épigénétique par le complexe SMC5/6 médie la latence du VIH-1. Nat Microbiol 7, 2101–2113 (2022). https://doi.org/10.1038/s41564-022-01264-z

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Reçu : 23 mai 2022

Accepté : 10 octobre 2022

Publié: 14 novembre 2022

Date d'émission : Décembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41564-022-01264-z

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Nature Reviews Biologie cellulaire moléculaire (2023)