Génome

Sep 15, 2023

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 7962 (2022) Citer cet article

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L'activité d,d-transpeptidase des protéines de liaison à la pénicilline (PBP) est la cible principale bien connue des antibiotiques β-lactamines qui bloquent la polymérisation des peptidoglycanes. La destruction bactérienne induite par les β-lactamines implique des réponses complexes en aval dont les causes et les conséquences sont difficiles à résoudre. Ici, nous utilisons le remplacement fonctionnel des PBP par une l,d-transpeptidase insensible aux β-lactamines pour identifier les gènes essentiels pour atténuer les effets de l'inactivation des PBP par les β-lactamines chez les bactéries en division active. Les fonctions des 179 gènes conditionnellement essentiels identifiés par cette approche s'étendent bien au-delà des partenaires l,d-transpeptidase pour la polymérisation du peptidoglycane pour inclure des protéines impliquées dans la réponse au stress et dans l'assemblage des polymères de la membrane externe. Les effets insoupçonnés des β-lactamines comprennent la perte de la liaison covalente médiée par les lipoprotéines qui relie la membrane externe au peptidoglycane, la déstabilisation de l'enveloppe cellulaire malgré une réticulation efficace du peptidoglycane et une perméabilité accrue de la membrane externe. Ce dernier effet indique que le mode d'action des β-lactamines implique une pénétration auto-promue à travers la membrane externe.

Les bactéries Gram-négatives, telles que Escherichia coli, possèdent une enveloppe multicouche qui soutient la pression de turgescence du cytoplasme (peptidoglycane de la paroi cellulaire) et agit comme une barrière chimique sélective pour les nutriments, les déchets et les composés toxiques (membranes interne et externe) (Fig. 1a)1. Plusieurs polymères contenant des fractions protéiques, peptidiques, glycanes et lipidiques assurent les propriétés mécaniques et les fonctions de transport de l'enveloppe. Le peptidoglycane (PG), qui est lié de manière covalente à la membrane externe via la lipoprotéine de Braun, est une macromolécule géante en forme de filet (environ 109 Da) polymérisée à partir d'une unité disaccharide-pentapeptide (Fig. 1b). Les glycosyltransférases catalysent la formation de liaisons glycosidiques β-1,4 entre les disaccharides pour former des chaînes de glycanes qui sont ensuite réticulées les unes aux autres par des transpeptidases (Fig. 1c). Ces dernières enzymes, les d,d-transpeptidases, sont également appelées protéines de liaison à la pénicilline (PBP) car elles sont les cibles essentielles des antibiotiques β-lactamines. Pour la polymérisation du peptidoglycane, les PBP interagissent avec l'extrémité d-Ala4-d-Ala5 d'une tige de pentapeptide (d'où la désignation d, d) et forment un lien covalent entre d-Ala4 et leur résidu Ser du site actif avec la libération concomitante de d-Ala5. Dans l'étape suivante, l'acyl-enzyme résultante réagit avec le second substrat, le plus souvent une tige tétrapeptidique, pour former un dimère Tetra-Tetra réticulé 4 → 3 avec la libération concomitante du PBP (Fig. 1c; Fig. Supplémentaire S1a)2. En coopération avec les protéines d'échafaudage et les endopeptidases, les d, d-transpeptidases interviennent dans l'insertion de brins de glycane dans la macromolécule en forme de réseau PG en expansion, déterminant ainsi la forme bactérienne et assurant une barrière mécanique contre la pression osmotique du cytoplasme pendant tout le cycle cellulaire3,4,5,6,7.

a L'enveloppe est composée de membranes interne (IM, grise) et externe (OM, noire). Le peptidoglycane (PG, bleu) assure la protection osmotique de la cellule bactérienne. La MI est une bicouche lipidique composée principalement de phospholipides (PL). L'OM est une bicouche lipidique asymétrique : le feuillet interne est composé de PL et le feuillet externe de lipopolysaccharides (LPS) et de phosphatidylglycérides substitués par l'antigène commun entérobactérien (ECAPGL). b Structure de la sous-unité PG (GlcNAc, N-acétyl-glucosamine ; MurNAc, acide N-acétyl-muramique). c Le PG est une macromolécule en forme de filet constituée de chaînes de glycanes (polygones bleu-violet) réticulées entre elles par de courtes tiges peptidiques (cercles colorés). Les PBP catalysent la formation de 4 → 3 réticulations reliant la 4ème position d'une tige donneuse d'acyle à la 3ème position de l'accepteur. Deux membres de la famille LDT (YcbB et YnhG) catalysent la formation de 3 → 3 cross-links. Trois LDT (ErfK, YbiS et YcfS) ancrent la lipoprotéine de Braun (Lpp) au PG. La liaison de DAP en 3ème position d'une tige donneuse de PG à l'extrémité Arg-Lys de la Lpp fournit un lien covalent entre l'OM et le PG. La liaison PG-Lpp est hydrolysée par le YafK LDT46,47. d Profil rpHPLC des muropeptides de la souche BW25113(ycbB, relA') cultivée sans ceftriaxone. La structure est déduite des fragments obtenus par digestion de PG avec des muramidases qui clivent la liaison MurNAc-GlcNAc β-1,4. e Structure des muropeptides déduite des analyses par spectrométrie de masse. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Le contournement de l'activité d,d-transpeptidase des PBP par des l,d-transpeptidases (LDT) structurellement non apparentées entraîne une résistance à la plupart des β-lactamines8,9. Les l,d-transpeptidases clivent la liaison peptidique l,d mésoDAP3-d-Ala4 des tiges tétrapeptidiques et forment 3 → 3 liaisons croisées (Fig. 1c; Fig. Supplémentaire S1b)10. D'autres membres de la famille des l,d-transpeptidase sont responsables de l'ancrage de la lipoprotéine de Braun au PG (Fig. S1c supplémentaire)11. L'activation de la voie de polymérisation principalement cryptique de la l,d-transpeptidase PG a été découverte pour la première fois chez des mutants résistants aux β-lactamines d'Enterococcus faecium sélectionnés in vitro12,13. La l,d-transpeptidation est le principal mode de réticulation des PG chez le pathogène Mycobacterium tuberculosis14 et peut être ciblée par les chimiothérapies de troisième ligne à base de β-lactame méropénème15. Chez E. coli, l'activation de la voie nécessite une surproduction à la fois de la YcbB l,d-transpeptidase (LdtD) et de la guanosine penta- ou tétraphosphate (p)ppGpp alarmone8. Il a ensuite été signalé que YcbB participait au maintien du PG car il compensait les défauts d'exportation des lipopolysaccharides16.

L'activité d,d-transpeptidase des PBP a été identifiée comme la cible principale des β-lactamines dans les années 196017. Néanmoins, déchiffrer la cascade d'événements en aval qui conduit à la mort bactérienne pose des défis particuliers18,19,20,21. Ce sujet reste l'objet d'intenses investigations.

Dans ce travail, nous étudions les fonctions essentielles au sauvetage de l'activité de réticulation 4 → 3 inactivée par les β-lactamines des PBP par l'activité de réticulation 3 → 3 de la l,d-transpeptidase YcbB à l'échelle du génome. Les résultats sont basés sur l'identification Tn-seq des gènes essentiels à la résistance aux β-lactamines médiée par YcbB, la construction de plusieurs délétions de gènes pour déchiffrer les relations épistatiques et la détermination de la structure de PG par spectrométrie de masse (Fig. 1d, e). Cette analyse ouvre une nouvelle fenêtre sur l'évolutivité de l'enveloppe cellulaire, sur le réseau complexe d'interactions liées à l'homéostasie des polymères de l'enveloppe et sur les mécanismes que développe E. coli pour lutter contre le stress induit par l'inactivation de la d,d-transpeptidase médiée par les β-lactamines.

Une approche de séquençage des transposons (Tn-seq)22 a été utilisée pour identifier les gènes essentiels à la résistance aux β-lactamines médiée par YcbB dans le génome d'E. coli BW25113(ycbB, relA')8. Cette souche combine une production élevée de l,d-transpeptidase YcbB et de (p)ppGpp synthétase RelA' lors de l'induction par l'IPTG et le l-arabinose des gènes ycbB et relA', respectivement. Deux conditions expérimentales, absence (-CRO) ou présence (+CRO) de ceftriaxone, ont été comparées. La ceftriaxone β-lactame a été choisie pour notre analyse car cette céphalosporine à large spectre de 3ème génération est très efficace pour inactiver toutes les d,d-transpeptidases appartenant à la famille PBP et est spécifique de ces enzymes car les l,d-transpeptidases ne sont pas inactivées en raison d'une combinaison d'acylation inefficace et de formation d'une acyl-enzyme sujette à l'hydrolyse23,24. Pour les deux conditions, IPTG et l-arabinose ont été ajoutés afin d'induire des gènes codant pour la YcbB l,d-transpeptidase et la RelA' (p)ppGpp synthase, respectivement. L'extraction de l'ADN génomique a été réalisée sur des pools de 810 000 (-CRO) et 260 000 (+CRO) transformants et séquencée. Des doublons techniques d'extractions d'ADN indépendantes ont révélé des coefficients de corrélation R2 de 0, 90 et 0, 94 pour les conditions -CRO et + CRO, respectivement (Fig. 2a, b). Les séquences contenant les jonctions ont été alignées sur le génome de référence E. coli BW25113 et les gènes essentiels identifiés en quantifiant la présence de lacunes dans les insertions (Fig. 2c). Le nombre moyen de lectures par gène a été comparé pour identifier les gènes dans lesquels les insertions de transposon étaient significativement sous-représentées (valeur p <0, 05) dans la condition + CRO (Fig. 2d; Fichier de données supplémentaire 1a).

a, b Corrélation des nombres de lecture moyens normalisés par CDS pour deux réplicats techniques séquencés obtenus pour les conditions -CRO et +CRO, respectivement. c Fréquence et localisation des insertions de transposons. Les anneaux, du plus externe au plus interne, correspondent : (i) aux coordonnées BW25113 ; (ii) les CDS sens (gris clair) et antisens (gris); (iii) le log2 du fold-change d'insertion pour les conditions -CRO versus +CRO. Les données pour les rapports -CRO à +CRO inférieurs et supérieurs à 1 apparaissent respectivement en jaune et en violet ; et (iv) les CDS sens et antisens spécifiquement essentiels dans la condition +CRO, respectivement. d Le diagramme de volcan représente les gènes pour lesquels l'inactivation du transposon est bénéfique ou préjudiciable dans la condition +CRO. L'axe X représente le log2 du facteur de variation des lectures moyennes par gène pour les conditions -CRO versus +CRO. L'axe Y représente le log10 négatif de la valeur p obtenue à partir du test t bilatéral non apparié. La zone rose correspond aux gènes avec un nombre d'insertions au moins 4 fois inférieur dans la condition +CRO avec une valeur p < 0,05. e Fonctions biologiques des gènes spécifiquement essentiels dans la condition +CRO. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Les analyses Tn-seq ont révélé que parmi les 4309 CDS annotés, 179 étaient sélectivement essentiels dans la condition +CRO selon une combinaison rigoureuse de trois critères comprenant (i) la présence d'un écart dans les insertions de transposon, (ii) une valeur de p significative (<0,05) et (iii) un facteur de variation supérieur à 4 (voir "Méthodes") (fichier de données supplémentaire 1b). Aucun gène ne s'est avéré sélectivement essentiel dans la condition -CRO. Les 179 gènes + CRO sélectivement essentiels ont été attribués à sept catégories fonctionnelles, la majorité étant impliquée dans le métabolisme des composants de l'enveloppe (N = 71, 40%) et dans les réponses au stress (N = 35, 20%) (Fig. 2e). Les profils Tn-seq pertinents des gènes discutés dans cette étude ont été compilés dans le fichier de données supplémentaire 2.

La synthèse du septum est médiée par des composants du divisome qui sont recrutés au milieu de la cellule par l'assemblage de l'anneau FtsZ (Fig. 3a)6. Les protéines du divisome central, FtsA, FtsEX, FtsQLB, FtsW, FtsZ, ZipA et PBP3, étaient chacune essentielles dans les conditions -CRO et +CRO. En revanche, les protéines associées au divisome impliquées dans le contrôle du cycle cellulaire (MinCD, FtsK)25,26, dans la stabilisation du divisome dans des conditions de stress (FtsP)27,28,29 et dans la fourniture d'un lien physique avec la membrane externe (TolABQR et Pal)30 n'étaient essentielles que dans la condition +CRO (fichier de données supplémentaire 1b ; fichier de données supplémentaire 2).

a, b Représentation schématique du divisome et de l'elongasome, respectivement. c Profils d'insertion Tn-seq des gènes codant pour les composants de l'elongasome. Les cadres de lecture sont indiqués en bas du panneau et codés par couleur : rouge, gènes sélectivement essentiels pour +CRO ; vert, gènes essentiels pour -CRO et +CRO ; gris, gènes non essentiels dans les deux conditions. Les sites d'insertion de transposon sont indiqués par des lignes au-dessus des cadres de lecture, leur hauteur reflétant le nombre de lectures pour chaque insertion. d Essentialité des gènes codant pour les composants d'elongasome PBP2 et RodA testés par mutagenèse dirigée. L'efficacité du placage a été testée en présence de ceftriaxone à 8 µg / ml (+ ceftriaxone) ou sans médicament (−ceftriaxone) sur des plaques de gélose BHI additionnées d'IPTG 40 µM et de l-arabinose à 1% pour l'induction de ycbB et relA ', respectivement. Les plaques ont été incubées à 28 °C car les souches hébergeant mrdA S330A et mrdA S330C ne se sont pas développées en présence de ceftriaxone à 37 °C.

L'expansion de la paroi latérale du peptidoglycane est médiée par l'elongasome (Fig. 3b), qui comprend (i) RodA, une glycosyltransférase appartenant à la famille des protéines de forme, d'élongation, de division et de sporulation (SEDS), (ii) PBP2, une PBP de classe B catalytiquement monofonctionnelle avec une activité d, d-transpeptidase, et (iii) MreB, une protéine de type actine formant un cytos d'échafaudage. squelette pour le complexe elongasome6.

Des analyses antérieures ont établi que l'elongasome est indispensable pour la croissance de mutants surproduisant le (p)ppGpp alarmone31,32. Comme prévu, l'analyse Tn-seq a indiqué que chacun des six gènes d'elongasome (mrdA, rodA, rodZ, mreB, mreC et mreD) était indispensable pour la croissance dans la condition -CRO, qui comprenait du l-arabinose pour la production de (p) ppGpp par RelA '(Fig. 3c). La croissance des mutants de l'élongasome dépendait en outre de l'expression du gène relA '(p)ppGpp synthase (Fig. S2a supplémentaire). De manière frappante, les six gènes d'elongasome étaient chacun essentiels dans la condition + CRO malgré la production de (p) ppGpp (Fig. 3c). Le caractère essentiel de PBP2 (codé par mrdA) était inattendu étant donné que ce PBP ne pouvait pas participer directement à la réticulation du PG en raison de l'inactivation de son domaine d, d-transpeptidase par la ceftriaxone8,33. Les composants de l'elongasome sont codés par des grappes de gènes compactes très sensibles aux effets polaires altérant potentiellement les niveaux de transcription des gènes adjacents. Nous avons donc complété nos résultats Tn-seq en utilisant une approche CRISPR-Cas9 (Fig. S2b supplémentaire) pour la mutagenèse dirigée en une étape de mrdA afin d'altérer l'activité transpeptidase de PBP2. L'expression de la résistance à la ceftriaxone a été abolie par la suppression de mrdA, mais pas par le remplacement du résidu Ser catalytique de la d, d-transpeptidase par Ala ou Cys (Fig. 3d; Fig. Supplémentaire S2c). Ainsi, PBP2, mais pas son activité transpeptidase, était essentielle pour la résistance aux médicaments.

Une approche CRISPR-Cas9 similaire, appliquée à la mutagenèse du gène rodA de la glycosyltransférase, a révélé qu'une forme catalytiquement active de la glycosyltransférase était nécessaire pour la croissance en présence de ceftriaxone (Fig. 3d; Fig. Supplémentaire S2c). Il a été montré précédemment que PBP2, RodZ, MreB, MreC et MreD sont chacun essentiels à l'assemblage de l'elongasome, et que l'interaction entre PBP2 et RodA ne dépend pas de l'activité de PBP234,35,36. Ainsi, la réticulation du PG par YcbB a nécessité la polymérisation des chaînes de glycane par RodA dans un elongasome fonctionnel contenant à la fois RodA et PBP2, l'activité transpeptidase de cette dernière enzyme étant dispensable.

Dans E. coli, 40 à 50 % du PG est dégradé par génération avec > 90 % des muropeptides résultants recyclés par la cellule37,38. Cela implique le transport rétrograde de fragments de PG dans le cytoplasme par des perméases spécialisées, AmpG et le complexe Opp, suivi du recyclage des fragments sucre et peptide sous forme de glucosamine et de tripeptide l-Ala-γ-d-Glu-DAP, respectivement (Fig. 4a). L'analyse Tn-seq a montré que les gènes codant pour la perméase AmpG et chaque composant du complexe Opp étaient totalement indispensables pour la croissance dans les conditions -CRO et + CRO. Nous avons en outre démontré que le recyclage du PG était totalement dispensable en construisant un triple mutant ΔampG ΔoppF ΔmppA qui s'est avéré viable et résistant à la ceftriaxone malgré la perte des deux transporteurs (Fig. S3a supplémentaire). Néanmoins, la l, d-carboxypeptidase cytoplasmique LdcA était essentielle dans la condition + CRO mais pas dans la condition -CRO (fichier de données supplémentaire 1b; fichier de données supplémentaire 2). Il a déjà été démontré que cette enzyme élimine le d-Ala4 des tiges de tétrapeptides recyclées pour fournir le tripeptide l-Ala-γ-d-Glu-DAP qui est directement ajouté à l'UDP-MurNAc par la ligase Mpl39,40. Il a été rapporté que la perturbation du gène codant pour LdcA entraînait une bactériolyse pendant la croissance stationnaire, attribuée à une réticulation considérablement réduite, car les tiges de tétrapeptide recyclées ne peuvent pas servir de donneurs d'acyle par les d, d-transpeptidases (Fig. S1 supplémentaire)40. La même explication ne peut rendre compte du rôle essentiel de LdcA dans la résistance à la ceftriaxone puisque YcbB utilise des tiges tétrapeptidiques comme donneurs d'acyle8. Néanmoins, le rôle essentiel de LdcA dans la condition + CRO découle de l'élimination des tétrapeptides importés puisque la suppression du gène mpl a restauré la croissance du mutant ΔldcA en présence de ceftriaxone (Fig. S3a supplémentaire). La surexpression de murA, codant pour l'enzyme catalysant la première étape engagée de la synthèse de PG (Fig. 4a), a également restauré la résistance du mutant ΔldcA (Fig. S3b supplémentaire). Ainsi, l'augmentation du flux métabolique par la voie d'assemblage du PG compense la toxicité des tétrapeptides importés. Ensemble, ces résultats indiquent que Mpl ligature le tétrapeptide sur UDP-MurNAc et qu'en l'absence de LdcA, les précurseurs contenant le tétrapeptide résultant sont utilisés de manière inefficace dans les étapes de synthèse de PG ultérieures et nuisent à l'efficacité globale de la voie.

a La sous-unité PG est assemblée à la fois par synthèse de novo (à gauche) et par recyclage de fragments de PG (à droite). b Synthèse de précurseurs de sucres nucléotidiques de l'acide colanique. c Assemblage de la sous-unité acide colanique liée au support lipidique undécaprényl. d Polymérisation et transport de l'acide colanique à la surface cellulaire. Abréviations : Ac acétyle ; support lipidique undécaprényl C55; Membrane interne IM ; Membrane externe OM ; Phosphate P; Pyrpyruvate.

DapF, qui convertit le l,l-DAP en mésoDAP, a été signalé comme étant indispensable pour la croissance d'E. coli41. MurE ligase catalyse l'ajout de l,l-DAP à UDP-MurNAc-l-Ala-d-Glu, bien que moins efficacement que l'ajout de mésoDAP en raison d'une différence de 3000 fois dans Km41. La délétion du gène codant pour DapF entraîne l'incorporation de 1,1-DAP dans les précurseurs de peptidoglycane. Les peptides souches contenant de la l,l-DAP ont été utilisés de manière inefficace comme donneurs d'acyle par les PBP, mais pas comme accepteur41. La réticulation globale du peptidoglycane a été modérément réduite41. De manière concordante, la l,l-DAP a été fortement discriminée de la mésoDAP par la PBP1b purifiée in vitro42. Dans notre étude, dapF n'était pas essentiel dans la condition -CRO. Au contraire, aucune insertion de transposon n'a été trouvée dans ce gène dans la condition +CRO (fichier de données supplémentaire 1b ; fichier de données supplémentaire 2). La formation de 3 → 3 dimères réticulés a été détectée dans un mutant ΔdapF (Fig. S4 supplémentaire) mais l'analyse par spectrométrie de masse n'a pas permis de faire la distinction entre les deux stéréoisomères DAP. Notre analyse de peptidoglycane a également montré que la suppression de dapF n'empêchait pas l'ancrage de la lipoprotéine de Braun au PG (Fig. S4 supplémentaire). Ainsi, les l,d-transpeptidases, de manière similaire aux PBP, ont toléré dans une certaine mesure l'incorporation de l,l-DAP dans les précurseurs de peptidoglycane après délétion de dapF. Le caractère essentiel de dapF dans la condition +CRO pourrait s'expliquer par une efficacité réduite de la voie d'assemblage PG, comme observé ci-dessus pour le mutant nul ldcA.

À l'exception de dapF, tous les gènes codant pour des enzymes impliquées dans les étapes de biosynthèse de PG connues pour être effectuées par une seule enzyme ont été identifiés comme essentiels dans les conditions + CRO et -CRO (Fig. 4a). Les données pour les étapes biosynthétiques essentielles impliquant des fonctions enzymatiques redondantes sont rapportées dans la Fig. S5 supplémentaire.

Le polymère le plus externe de la paroi cellulaire de la plupart des souches d'E. coli est une capsule constituée d'acide colanique43. WcaJ catalyse la première étape engagée dans l'assemblage du précurseur de l'acide colanique. Le gène codant pour WcaJ n'était pas essentiel dans les conditions -CRO et + CRO, indiquant que l'absence de la capsule était compatible pour la croissance en l'absence ou en présence de ceftriaxone (Fig. 4b – d). De manière inattendue, toutes les autres enzymes de la voie de synthèse de l'acide colanique étaient essentielles dans les conditions + CRO mais pas dans les conditions -CRO (fichier de données supplémentaire 1b; fichier de données supplémentaire 2). Étant donné que la perte de toutes les autres enzymes de biosynthèse de l'acide colanique devrait entraîner une accumulation de précurseurs liés à l'undécaprényle, nous avons conclu que ces enzymes sont essentielles pour empêcher la séquestration du transporteur lipidique. Selon ce modèle, la séquestration de C55 inhiberait indirectement l'assemblage d'autres polymères, tels que le PG essentiel, qui reposent sur le même support lipidique. En guise de confirmation, nous avons montré que la suppression du gène codant pour WcaJ, catalysant la première étape engagée de la synthèse du précurseur de l'acide colanique, rétablissait la croissance d'un mutant WcaI en présence de ceftriaxone (Fig. S6a supplémentaire). Combinés, ces résultats indiquent que la capsule est, en soi, non essentielle pour la croissance en présence de ceftriaxone, bien que les enzymes biosynthétiques de l'acide colanique soient essentielles pour empêcher la synthèse réduite de PG par séquestration du support lipidique.

Trois polymères ECA sont assemblés à partir du même précurseur lié à C55 (Fig. 5)44. Les ECA composés de 1 à 14 unités du précurseur sont liés de manière covalente à des lipopolysaccharides (ECALPS) ou à des phosphatidylglycérides (ECAPGL) dans le feuillet externe de la membrane externe. Les ECA cycliques libres (ECACYC), constitués de quatre unités, sont situés dans le périplasme.

a Synthèse de précurseurs nucléotide-sucre ECA. b Assemblage de la sous-unité ECA liée au support lipidique undécaprényl. c Polymérisation et transport des ECA à la surface cellulaire. d Synthèse de précurseurs de nucléotide-sucre de LPS de base. e Assemblage du noyau LPS. f Transport du LPS vers la surface cellulaire. Abréviations : support lipidique undécaprényl C55 ; Membrane interne IM ; Membrane externe OM ; Phosphate P.

Aucun des trois polymères ECA n'était essentiel dans la condition -CRO puisque des insertions de transposon ont été détectées dans des gènes codant pour des enzymes impliquées dans la synthèse de précurseurs nucléotidiques-sucre (Fig. 5a) et pour l'assemblage de la sous-unité trisaccharidique liée à C55 (Fig. 5b). En revanche, la plupart des enzymes étaient essentielles dans la condition + CRO indiquant qu'au moins un des trois polymères ECA était essentiel pour la résistance (Fichier de données supplémentaire 1b ; Fichier de données supplémentaire 2). La synthèse d'ECALPS et d'ECACYC était indispensable pour la résistance puisque la suppression des gènes codant pour les ligases WaaL et WzzE, seules ou en combinaison, était indispensable pour la croissance en présence de ceftriaxone (Fig. 5c; Fig. Supplémentaire S6b). Le phénotype du double mutant indique l'absence de redondance entre l'ECALPS et l'ECACYC pour la résistance à la ceftriaxone. Par élimination, ces résultats indiquent que la synthèse d'ECAPGL est essentielle pour la résistance bien que cela n'ait pas pu être directement établi car la polymérase correspondante n'a pas encore été identifiée.

Le lipide A, substitué par deux résidus 3-désoxy-d-manno-octulosonate, est connu pour être le fragment minimal de LPS requis pour la croissance d'E. coli45. En conséquence, la plupart des enzymes impliquées dans sa synthèse et son transport vers la membrane externe étaient essentielles dans les conditions -CRO et + CRO (Fig. 5d – f). Les enzymes en aval, responsables de la synthèse de la sous-unité ADP-l-glycéro-d-manno-heptose (RpiA, Rpe, GmhA, HldE, GmhB et HldD), de l'ajout d'un d-manno-heptose à la chaîne saccharidique (WaaC) et de la phosphorylation de ce résidu (WaaP), n'étaient essentielles qu'en condition +CRO. Les ajouts de résidus de 2e d-manno-heptose (WaaF) et de d-glucose (WaaG) étaient également essentiels pour la résistance (fichier de données supplémentaire 1b ; fichier de données supplémentaire 2). Les enzymes catalysant les trois étapes suivantes dans l'assemblage du noyau externe (WaaQ, B et R) étaient nécessaires pour une croissance optimale dans la condition +CRO. Seules trois enzymes de la voie (WaaY, J et U) étaient entièrement dispensables à la fois dans les conditions -CRO et +CRO. Ces résultats indiquent que la croissance en présence de ceftriaxone n'était pas compatible avec une synthèse incomplète de LPS.

Les tests ponctuels ont révélé que la croissance dans la condition +CRO était associée à un phénotype mucoïde, un phénotype connu pour résulter d'une surproduction d'acides colaniques par des cellules stressées. Cette observation soulève la possibilité formelle que l'essentialité des sucres de base ldcA, dapF, ECAPGL et LPS dans la condition +CRO (ci-dessus) puisse dépendre de la surproduction d'acides colaniques par des bactéries exposées à la ceftriaxone. Ce n'était pas le cas puisque ldcA, dapF, wecA et waaC sont restés essentiels dans les souches ΔwcaJ déficientes en synthèse d'acide colanique (Fig. S6c supplémentaire).

Le génome d'E. coli code pour six membres de la famille des protéines LDT (Fig. S1 supplémentaire). YcbB et YnhG catalysent la formation de liaisons croisées 3 → 3 tandis que ErfK, YbiS et YcfS sont responsables de la liaison covalente de la lipoprotéine de Braun (Lpp) à PG10,11. L'enzyme restante, YafK, hydrolyse la liaison Lpp-PG formée par ErfK, YbiS et YcfS, libérant ainsi la lipoprotéine46,47. L'analyse Tn-seq a montré que la lipoprotéine de Braun est indispensable pour la croissance dans les conditions -CRO et +CRO. Les analyses de la structure du PG ont révélé que la croissance en présence de ceftriaxone réduisait considérablement l'ancrage de la lipoprotéine de Braun au PG (Fig. S7 supplémentaire). Les analyses par Western blot ont montré que la synthèse de Lpp n'était pas réduite dans la condition + CRO (Fig. S7g supplémentaire). Ainsi, la ceftriaxone peut inhiber la réaction d'ancrage catalysée par les LDT (Fig. S1 supplémentaire), mais il est peu probable que cette inhibition soit directe puisque les LDT ne sont pas efficacement inhibés par les β-lactames, à l'exception de ceux appartenant à la classe des carbapénèmes23,24.

Toute hypothèse sur le mode d'inhibition de l'ancrage de la Lpp à la PG par les β-lactamines doit prendre en considération le fait que les LDT pour la réticulation de la PG (YcbB et YnhG) et pour l'ancrage de la Lpp (ErfK, YbiS et YcfS) interagissent avec le même substrat donneur, une tige donneuse tétrapeptidique, dans la première étape catalytique commune aux deux types de réactions de l,d-transpeptidation (Fig. S1b supplémentaire, S1c)12. Dans la deuxième étape, les enzymes acyles résultantes réagissent soit avec une tige de peptidoglycane pour former des réticulations 3 → 3, soit avec Lpp pour lier de manière covalente la lipoprotéine à PG. Le substrat commun de la première étape des réactions de transpeptidation implique que la compétition des LDT pour un même donneur tétrapeptidique, comme proposé précédemment47, peut contribuer à limiter l'ancrage de la lipoprotéine de Braun au PG. Cependant, cela semble peu probable dans le contexte de la résistance à la ceftriaxone médiée par YcbB, car la proportion élevée de liaisons croisées 3 → 3 dans la condition + CRO (40%) n'a pas nui à l'ancrage de la Lpp (Fig. S7 supplémentaire). Ainsi, l'altération de l'ancrage Lpp en présence de ceftriaxone peut résulter d'un autre effet inhibiteur indirect de la ceftriaxone sur l'activité de ErfK, YbiS et YcfS, comme la formation de leur substrat tétrapeptidique par une enzyme partenaire, ou la stimulation de la libération de la lipoprotéine par YafK.

Après avoir évalué le rôle des composants de la membrane externe sur l'intégrité de la membrane externe en présence de ceftriaxone, notre objectif suivant était de déterminer sa fonctionnalité en tant que barrière de perméabilité. En l'absence d'inducteurs de ycbB et relA ', l'hydrolyse du chlorophénol rouge-β-d-galactopyranoside (CPRG) par la LacZ β-galactosidase cytoplasmique a été détectée dans un anneau étroit au périmètre de la zone d'inhibition de la ceftriaxone (Fig. 6a). Ainsi, l'exposition à des concentrations sous-inhibitrices proches de la concentration minimale inhibitrice (MIC) du médicament a entraîné une augmentation de la perméabilité car il n'y a pas de transporteur spécifique pour le CPRG. Lors de l'induction de ycbB et relA', l'activité de LacZ a été détectée dans une large zone montrant que la ceftriaxone augmentait la perméabilité à des concentrations bien inférieures à la CMI de cette souche. La croissance en présence de ceftriaxone a sensibilisé les bactéries au dodécylsulfate de sodium (SDS), entraînant une réduction > 40 fois de la CMI du détergent (Fig. 6b). La croissance en présence de ceftriaxone a également augmenté la sensibilité à la vancomycine, à la moénomycine, à la bacitracine et à l'érythromycine, qui sont connues pour pénétrer mal la membrane externe des bactéries Gram-négatives (Fig. 6c). Ensemble, ces données indiquent que le contournement des PBP par YcbB était associé à la perméabilisation de la membrane externe en présence de ceftriaxone. Cela implique que le mode d'action des β-lactamines peut impliquer une boucle positive dans laquelle la liaison des médicaments à leurs cibles favorise l'accès des médicaments au périplasme. Des dommages à la membrane externe médiés par des espèces réactives de l'oxygène (ROS) peuvent être impliqués dans ce processus, car une peroxydation lipidique accrue a été détectée par un dosage colorimétrique (Fig. S7h supplémentaire).

a Hydrolyse de CPRG chromogénique à 20 µg/ml par LacZ63 cytoplasmique. Les disques ont été chargés avec 30 µg de ceftriaxone. b Efficacité du placage en présence de SDS. La croissance a été testée en présence de ceftriaxone à 8 µg/ml (+ ceftriaxone) ou en l'absence du médicament (−ceftriaxone) sur des plaques de gélose BHI additionnées d'IPTG 40 µM et de l-arabinose à 1 % pour l'induction de ycbB et relA', respectivement. c Diamètres d'inhibition des médicaments qui ne pénètrent pas dans la membrane externe d'E. coli de type sauvage. Les valeurs sont la médiane de trois répétitions biologiques. d Cascade d'événements conduisant à la mort des cellules bactériennes due à l'inactivation des PBP par les β-lactamines. e Sauvetage de l'inactivation de PBP par la YcbB l,d-transpeptidase. Abréviations : membrane interne IM ; Membrane externe OM ; lipoprotéine Lpp Braun; Protéines de la membrane externe des OMP. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Les cibles des β-lactamines et le mécanisme de leur inactivation sont connus depuis des décennies, et pourtant la compréhension de la cascade d'événements en aval qui conduit à la mort des cellules bactériennes reste mal comprise. Le modèle le plus récent (Fig. 6d) propose que l'inactivation des PBP entraîne la production de chaînes de glycanes non réticulées dans le périplasme et leur clivage ultérieur par des enzymes lytiques19,21. La demande anabolique générée par ce cycle futile de synthèse et de dégradation de PG engendre des altérations du métabolisme central du carbone, de la synthèse des protéines et de l'utilisation de l'ATP conduisant à la production de ROS qui endommagent les biomolécules, notamment l'ADN, l'ARN, les protéines et les lipides. Le stress oxydatif qui en résulte contribue à la mort cellulaire18,48.

Le sauvetage de l'inactivation des PBP par YcbB implique, dans son sens le plus simple, un contournement de l'activité de réticulation des PBP par le remplacement de 4 → 3 par 3 → 3 liens croisés (Fig. 1). Cependant, notre analyse montre que la résistance aux β-lactamines est significativement plus complexe puisque les effets toxiques de l'inactivation des PBP persistent malgré le contournement de leur activité d,d-transpeptidase par YcbB. En accord, une peroxydation lipidique accrue a été détectée dans la condition + CRO (Fig. S7h supplémentaire). Les gènes identifiés comme sélectivement essentiels dans la condition +CRO (Fig. 2; Fichier de données supplémentaire 1b) ont révélé la complexité des fonctions mobilisées pour atténuer ces effets toxiques (Fig. 6e).

Le découplage de la transglycosylation médiée par RodA de la transpeptidation médiée par PBP2 lors de l'inactivation de ce PBP par les β-lactamines s'est déjà avéré avoir des effets opposés sur la viabilité des bactéries sensibles et résistantes. Chez les bactéries sensibles, l'accumulation de brins de glycanes non réticulés suite à l'inactivation de PBP2 par les β-lactamines est délétère et leur dégradation par la transglycosylase lytique SltY contribue à la survie cellulaire21. En revanche, l'inactivation de SltY favorise la résistance médiée par YcbB aux β-lactamines, les brins de glycane non réticulés formés par le complexe elongasome servant de substrats appropriés pour l'assemblage d'un polymère PG fonctionnel7. Des expériences de marquage par impulsions ont indiqué que YcbB supportait la polymérisation du PG via un mécanisme en deux étapes impliquant (i) l'assemblage de 3 → 3 brins de glycanes réticulés suivi de (ii) l'insertion du polymère néo-synthétisé résultant dans le PG49 existant. Dans le présent travail, nous fournissons des preuves directes que ce mode de polymérisation du peptidoglycane nécessite un elongasome fonctionnel, soutenant la polymérisation du brin de glycane par RodA catalytiquement actif (Fig. 3).

Le recyclage du PG est stimulé dans la condition +CRO49. Cela implique que le sauvetage des PBP par YcbB réduit mais n'abolit pas la forte demande anabolique nécessaire pour alimenter la voie d'assemblage des PG en présence du médicament. Ici, nous montrons que la réduction du flux métabolique des précurseurs dans la voie d'assemblage du PG n'est pas compatible avec la résistance aux β-lactamines médiée par YcbB. Cela a été observé comme étant le cas pour les délétions dapF ou ldcA, qui ont conduit à la synthèse de précurseurs aberrants contenant respectivement l, l-DAP ou une tige tétrapeptidique (Fig. 4a). C'était également le cas pour l'inactivation des gènes codant pour les enzymes de synthèse de l'acide colanique qui ont conduit à la séquestration du support lipidique undécaprényl utilisé de manière compétitive pour la synthèse de PG (Fig. 4b – d). L'excès résiduel de la demande anabolique peut également avoir des conséquences non directement liées à l'efficacité de la synthèse de PG. En effet, une demande anabolique élevée implique que la production de ROS reste élevée. La défense réussie contre le stress oxydatif qui en résulte peut expliquer les rôles sélectivement essentiels des régulateurs, des chaperons et des enzymes impliqués dans la réparation des macromolécules (Fig. 2e; Fichier de données supplémentaire 1b).

Étonnamment, nous avons constaté que la résistance dépendait également de l'ECAPGL (Fig. 5a), du LPS portant un sucre à noyau complet (Fig. 5b – d), des composants du système Tol-Pal (Fig. 3a) et des protéines de la membrane externe, y compris OmpA et OmpC (Fichier de données supplémentaire 1b; Fichier de données supplémentaire 2). Des analyses de morphologie bactérienne ont récemment montré que la membrane externe contribue directement aux propriétés mécaniques de l'enveloppe cellulaire, un rôle historiquement attribué uniquement à la couche de PG50,51. De manière frappante, les composants stabilisants essentiels à la rigidité de la membrane externe identifiés dans l'un de ces rapports précédents50 comprenaient le LPS portant un sucre à noyau complet, le système Tol-Pal et OmpA, également identifié ici comme essentiel pour la résistance à la ceftriaxone médiée par YcbB. Ainsi, l'assemblage d'une enveloppe fonctionnelle en présence de ceftriaxone a nécessité à la fois le contournement de l'activité d,d-transpeptidase des PBP par l'activité l,d-transpeptidase de YcbB et l'insertion de polymères critiques dans la membrane externe.

En conclusion, le sauvetage des PBP par YcbB, couplé à un criblage Tn-seq à l'échelle du génome, a révélé deux impacts inattendus des β-lactamines. Premièrement, l'exposition à la ceftriaxone a empêché l'ancrage médié par la l, d-transpeptidase de la lipoprotéine de Braun à la PG (Fig. S7 supplémentaire). Deuxièmement, l'exposition à la ceftriaxone a augmenté la perméabilité de la membrane externe (Fig. 6). Ce dernier effet implique que la pénétration auto-promue à travers la membrane externe est une facette jusque-là non reconnue du mode d'action des β-lactamines. De plus, nos données montrent que le cycle futile induit par les β-lactamines n'était durable que si l'efficacité de la voie d'assemblage des peptidoglycanes n'était pas compromise par des étapes de biosynthèse inefficaces ou par la concurrence avec l'assemblage d'autres polymères reposant sur le support lipidique undécaprényl commun. Le PG réticulé par YcbB était fonctionnel bien que l'intégrité de l'enveloppe cellulaire reposait fortement sur des polymères de membrane externe qui étaient autrement inutiles pour la croissance. Ainsi, l'identification des gènes impliqués dans le sauvetage des PBP par YcbB a fourni un crible positif pour identifier les réponses bactériennes qui empêchent la destruction bactérienne par les β-lactamines. En revanche, les analyses métaboliques restreintes aux bactéries sensibles sont insensibles aux différences entre les perturbations spécifiques aux antibactériens et la multitude d'effets secondaires liés à la mort cellulaire19. En conséquence, notre analyse fournit des preuves convaincantes que la membrane externe, au-delà de son rôle bien connu de barrière de perméabilité52, est un acteur clé dans le mode d'action des β-lactamines et dans la résistance aux β-lactamines médiée par la l,d-transpeptidase, comme précédemment trouvé pour la tolérance à ces médicaments chez diverses espèces bactériennes53,54,55,56. À son tour, notre analyse identifie des cibles exploitables potentielles pour renforcer l'efficacité des β-lactamines contre les bactéries résistantes.

Les caractéristiques et l'origine des plasmides et des souches utilisées dans l'étude sont répertoriées dans le tableau supplémentaire S1. Les bactéries ont été cultivées à 37 ° C dans une gélose ou un bouillon d'infusion cerveau-cœur (BHI; Difco) avec aération (agitation à 180 tr / min). La kanamycine à 50 µg/ml a été utilisée pour la sélection des transductants portant la cassette KmR issue de la collection Keio. Les milieux de croissance ont été complétés de manière systémique avec des médicaments pour contre-sélectionner la perte de plasmide : 10 ug/ml de tétracycline pour le plasmide pKT2, 20 ug/ml de chloramphénicol pour pKT8, 25 ug/ml de zéocine pour pHV30 et dérivés. L'induction des promoteurs Ptrc, ParaBAD et PrhaBAD a été réalisée avec de l'isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG, 40 µM), du l-arabinose (1 %) et du l-rhamnose (0,2 %), respectivement. Les plasmides construits dans cette étude ont été obtenus en utilisant la méthode d'assemblage d'ADN NEBuilder HiFi (New England Biolabs), sauf indication contraire. Des délétions de gènes spécifiques ont été obtenues par transduction P1 de la cassette KmR de mutants sélectionnés de la collection Keio57,58. Pour les délétions multiples de gènes, la cassette KmR a été éliminée par la recombinase FLT codée par le plasmide pCP20.

Une colonie fraîche d'Escherichia coli BW25113 ΔrelA pKT2(ycbB) pKT8(relA') a été cultivée dans 10 ml de bouillon BHI additionné de 10 ug/ml de tétracycline et 20 ug/ml de chloramphénicol. À une densité optique à 600 nm (OD600nm) d'env. 0,8, les cellules ont été récoltées par centrifugation et lavées quatre fois avec 10 ml de H2O à 4 °C. Des électroporations multiples (voir ci-dessous) ont été réalisées en utilisant 100 µl de cellules électrocompétentes et 1 µl de transposome EZ-Tn5 < KAN-2 > (Lucigen). Pour chaque électroporation, les cellules transformées ont été incubées à 37 °C pendant 1 h dans 2 ml de bouillon BHI additionné de 10 µg/ml de tétracycline et 20 µg/ml de chloramphénicol. Les cellules ont été étalées sur 20 plaques de gélose BHI (100 µl par plaque) additionnées de 50 µg/ml de kanamycine, 40 µM d'IPTG et 1 % de l-arabinose en l'absence (condition -CRO) ou en présence (condition +CRO) de 8 µg/ml de ceftriaxone. Les plaques ont été incubées à 37 °C pendant 16 h (condition -CRO) ou 24 h (condition +CRO). Les cellules ont été récupérées à partir d'ensembles de 20 plaques (correspondant à la même électroporation) en deux étapes par grattage avec 4 ml de bouillon BHI contenant 20% de glycérol suivi d'un lavage supplémentaire des plaques avec 4 ml du même milieu. Les suspensions bactériennes obtenues pour chaque électroporation ont été maintenues à -80 °C. Pour la condition -CRO, un total de 810 000 UFC a été obtenu en 7 électroporations. Pour la condition + CRO, un total de 260 000 UFC a été obtenu en 10 électroporations.

Pour l'extraction d'ADN, 10 µl des suspensions bactériennes obtenues dans les électroporations 7 (condition -CRO) ou 10 (+ condition CRO) ont été regroupées. L'extraction de l'ADN a été réalisée avec le kit de purification d'ADN Wizard Genomic (Promega) en double pour obtenir des répétitions techniques.

La préparation des bibliothèques d'ADN et le séquençage Illumina ont été réalisés par la société Viroscan3D et la plateforme ProfileXpert de l'Université de Lyon 1. En bref, l'ADN a été fragmenté (environ 300 pb) et des adaptateurs P5 Illumina ont été liés à l'ADN fragmenté. Les fragments de jonction des deux côtés de EZ-Tn5 ont été amplifiés à l'aide de l'amorce P5 Illumina standard en association avec l'amorce d'hybridation Tn5 HV1 ou HV2 portant l'adaptateur P7 Illumina à l'extrémité 5 '(tableau supplémentaire S1). Les index étaient portés par les amorces Tn gauche ou Tn droite. Le séquençage Illumina a été réalisé sur un NextSeq Mid Output 150 bp (paired-end : 40-110). Le démultiplexage et le découpage des lectures ont été effectués avant l'alignement avec le génome de référence E. coli BW25113 (numéro d'accès NCBI : CP009273).

L'analyse a été réalisée avec le package Python (v.3.7) TRANSIT (v.3.0+)59. Le composant TPP a été utilisé pour traiter les lectures expérimentales brutes et générer des fichiers WIG pour une analyse en aval. Les lectures d'extrémités appariées Illumina avec les sites d'insertion EZ-Tn5 ont été identifiées en sélectionnant d'abord celles avec la séquence d'extrémité de transposon 'TAAGAGACAG' attendue entre les nucléotides 25 et 50 de chaque lecture. La séquence inverse de 110 pb (amorce de séquençage de l'adaptateur P7) a été utilisée dans tous les cas car elle contenait à la fois les séquences EZ-Tn5 et génomique. Les lectures EZ-Tn5 ont ensuite été cartographiées sur la séquence de référence E. coli BW25113 à l'aide de BWA (v.0.7.17)60. Des fichiers WIG combinés correspondant aux jonctions gauche et droite ont été générés pour chaque expérience. Les événements d'insertion de transposon ont été attribués à des cadres de lecture ouverts spécifiques/gènes à l'aide du fichier GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/) GFF3 correspondant à la séquence génomique FASTA. La normalisation du nombre d'inserts par ORF/gène a été effectuée par Trimmed Total Reads (TTR) : nombre total de lectures normalisé après avoir coupé les 5 % supérieurs et inférieurs des nombres de lectures. Le nombre moyen d'insertions a été calculé pour chaque condition expérimentale : moyenne des jonctions gauche et droite de chacune des deux expériences.

Les fragments de jonction ont été alignés sur le génome de référence E. coli BW25113 et les gènes essentiels ont été appelés à l'aide de l'algorithme Tn5Gaps du pipeline TRANSIT (fichier de données supplémentaire 1a)59. L'ensemble des gènes sélectivement essentiels dans la condition +CRO a été construit par : (1) Identification des gènes essentiels dans les deux réplicats du +CRO et non essentiels dans les deux réplicats du -CRO (sous-ensemble 1). (2) Ajout de gènes avec une divergence parmi les doublons techniques, par exemple marqués comme non essentiels dans un ensemble de données +CRO ou essentiels dans un ensemble de données −CRO (sous-ensemble 2). (3) Les lectures moyennes par gène ont été calculées pour identifier les insertions de transposons qui sont significativement (valeur p <0, 05) sous-représentées dans la condition + CRO (fichier de données supplémentaire 1a). Les gènes des sous-ensembles 1 et 2 qui ont donné une valeur de p > 0,05 ou un fold-change < 4 ont été éliminés. L'ensemble résultant de 179 gènes est répertorié dans le fichier de données supplémentaire 1b. Pour les voies ou les groupes de gènes contenant des gènes sélectivement essentiels dans la condition +CRO, nous avons également considéré les gènes non essentiels présentant un nombre significativement réduit d'insertions dans la condition +CRO (p < 0,05). Ces gènes ont été jugés encourir un coût de remise en forme.

Les séquences de guidage de 20 nucléotides ciblant mrdA (GTCTACAGTTAAACCCTATG) et rodA (GGTGGCTGCACAGCCTGACC) ont été introduites indépendamment dans le plasmide pTargetF61 par amplification PCR inversée à l'aide des amorces HV3 et HV4 ou HV5 et HV6 (tableau supplémentaire S1) pour générer pTargetF-mrdA et pTargetF-rodA, respectivement. En bref, pTargetF a été amplifié par PCR avec l'ADN polymérase Phusion (Thermo Scientific), les produits de PCR ont été digérés par l'enzyme de restriction DpnI (Thermo Scientific) et purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose. Les produits de PCR purifiés ont été phosphorylés et ligaturés avec la polynucléotide kinase T4 et l'ADN ligase T4 (Thermo Scientific) dans une réaction à un pot, et les plasmides pTargetF-mrdA et pTargetF-rodA résultants ont été introduits dans E. coli TOP10 par électroporation.

Les ADN donneurs mrdA S330A, mrdA S330C, rodA D159A, rodA D159N, ΔmrdA et ΔrodA ont été synthétisés par GeneCust et clonés dans pUC57. Les ADN donneurs utilisés pour introduire des mutations ponctuelles correspondent à la séquence du mrdA ou du rodA avec mutation faux-sens dans le codon d'intérêt et des mutations silencieuses dans la séquence correspondant aux 20 nucléotides utilisés pour guider Cas9 sur la copie chromosomique du gène (pour éviter un clivage ultérieur par Cas9 après échange allélique). Les ADN donneurs utilisés pour introduire les délétions correspondent aux 100 pb en amont, aux six premiers codons, aux huit derniers codons et aux séquences de 100 pb en aval de mrdA ou rodA. Les ADN donneurs ont été indépendamment amplifiés par PCR avec l'ADN polymérase Phusion (Thermo Scientific) et les amorces HV7 à HV14 décrites dans le tableau supplémentaire S1. Les produits de PCR ont été digérés avec l'enzyme de restriction DpnI (Thermo Scientific) et purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose.

Méthode adaptée de Jiang Y. et al.61. Une colonie fraîche de E. coli BW25113 ΔrelA pKT8(relA') pCas a été cultivée à 30 °C sous agitation dans 10 ml de bouillon BHI additionné de 1 % de l-arabinose pour induire l'expression de relA' et du système λ Red, et avec 20 µg/ml de chloramphénicol et 50 µg/ml de kanamycine pour contrer la perte des plasmides. À un OD600nm d'env. 0,8, les cellules ont été récoltées par centrifugation et lavées quatre fois avec 10 ml de H2O à 4 °C. Les bactéries ont été électroporées avec le plasmide pTargetF-mrdA et l'ADN donneur mrdA S330A, mrdA S330C ou ∆mrdA, ou avec le plasmide pTargetF-rodA et l'ADN donneur rodA D159A, rodA D159N ou ∆rodA avec un rapport moléculaire de 1 plasmide pour 5000 molécules d'ADN donneur. Les cellules transformées ont été incubées à 30 °C pendant 2 h dans 1 ml de bouillon BHI additionné de 1 % de l-arabinose, 20 µg/ml de chloramphénicol et 50 µg/ml de kanamycine. Les bactéries ont été étalées sur de la gélose BHI additionnée de 1 % de l-arabinose, 50 µg/ml de kanamycine et 120 µg/ml de spectinomycine et incubées à 30 °C pendant 24 h. Pour se débarrasser de pTargetF-mrdA ou pTargetF-rodA, les transformants ont été isolés sur le même milieu additionné de 500 µM d'IPTG pour l'induction du sgRNA codé par pCas ciblant le plasmide pTargetF et incubés à 30 ° C pendant 24 h. Les délétions chromosomiques ou mutations ponctuelles ont été vérifiées par PCR et séquençage Sanger. Pour se débarrasser du plasmide pCas thermosensible, des clones portant les mutations attendues ont été cultivés dans un bouillon BHI additionné de 1 % de l-arabinose et de 500 µM d'IPTG à 37 °C pendant 6 h et isolés sur de la gélose BHI additionnée de 1 % de l-arabinose à 37 °C pendant 16 h. Les clones isolés ont été sous-cultivés dans du bouillon BHI additionné de 1 % de l-arabinose à 37 °C pendant 6 h et isolés sur de la gélose BHI additionnée de 1 % de l-arabinose à 37 °C pendant 16 h. La sensibilité des clones isolés à la spectinomycine (perte de dérivés de pTargetF) et à la kanamycine (perte de pCas) a été testée pour confirmer la perte de ces plasmides.

Les bactéries ont été cultivées jusqu'à la phase exponentielle tardive, c'est-à-dire jusqu'à une DO600nm de 1,0 à 4,0 (environ 6 h à 37 °C avec agitation vigoureuse). La DO600nm a été ajustée à 1,0 et des dilutions de 10 fois (10-1 à 10-5) ont été préparées dans du bouillon BHI. Cinq ul des suspensions bactériennes résultantes ont été déposés sur des plaques de gélose BHI additionnées d'inducteurs et de médicaments comme indiqué dans la légende des figures. Pour le test de diffusion sur disque, 5 ul de la suspension bactérienne à une DO600nm de 1,0 ont été inoculés dans 5 ml d'eau. Des plaques de gélose BHI ont été inondées avec cette dernière suspension, l'excès de liquide a été éliminé et les plaques ont été maintenues à température ambiante pendant 15 minutes avant l'ajout de disques de papier contenant des antibiotiques. Pour le test de chlorophénol rouge-β-d-galactopyranoside (CPRG), la souche BW25113(ycbB, relA') hébergeant pHV30bis(lacZ) a été utilisée puisque la souche parentale BW25113 n'exprime pas la copie chromosomique de lacZ. Les plaques ont été imagées ou les diamètres d'inhibition ont été mesurés après 16 h (ou 24 h pour les plaques contenant de la ceftriaxone) d'incubation à 37 °C. Les données présentées sur les figures sont représentatives d'au moins deux répétitions biologiques et les diamètres d'inhibition mesurés sont la médiane de trois répétitions biologiques.

Les bactéries ont été cultivées dans du bouillon BHI jusqu'à la phase exponentielle tardive, c'est-à-dire jusqu'à une DO600nm supérieure à 1,0 (environ 6 h à 37 °C sous agitation). Dix µl des suspensions bactériennes résultantes ont été étalés sur de la gélose BHI additionnée d'inducteurs (40 µM IPTG et 1 % de l-arabinose) et de médicaments (10 µg/ml de tétracycline et 20 µg/ml de chloramphénicol ou 8 µg/ml de ceftriaxone). Pour chaque réplique, 5 plaques de gélose BHI ont été utilisées afin d'obtenir une quantité suffisante de bactéries. Les plaques ont été incubées pendant 16 h (ou 24 h pour les plaques contenant de la ceftriaxone) à 37 °C. Les bactéries ont été récoltées en deux étapes en grattant chaque plaque avec 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pH 7,2 suivi d'un lavage supplémentaire de la plaque avec 1 ml de PBS. Les bactéries ont été bouillies dans du PBS 0, 5 × additionné de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 4% dans un volume final de 20 ml pendant 1 h. Les sacculi ont été récoltés par centrifugation (20 000 × g pendant 20 min à 20 ° C), lavés cinq fois avec 20 ml d'eau, remis en suspension dans 1 ml de Tris-HCl 20 mM pH 7, 5 et incubés avec 100 µg / ml pronase à 37 ° C pendant 16 h. Les sacculi ont été lavés cinq fois avec 1 ml d'eau, remis en suspension dans 1 ml de phosphate de sodium 20 mM pH 8,0 et incubés avec 100 µg/ml de trypsine à 37 °C pendant 16 h. Les sacculi ont été lavés cinq fois avec 1 ml d'eau, bouillis pendant 5 min, récupérés par centrifugation, remis en suspension dans 300 µl d'eau et stockés à -20 ° C.

Dix µl de sacculi purifiés ont été digérés avec 120 µM de lysozyme dans du Tris-HCl 40 mM pH 8,0 à 37 °C pendant 16 h. La matière insoluble a été éliminée par centrifugation à 20 000 × g dans une microcentrifugeuse pendant 10 min, et la fraction soluble contenant les muropeptides a été réduite avec du borohydrure de sodium dans un tampon borate 125 mM pH 9, 0 pendant 1 h à température ambiante. L'acide phosphorique a été utilisé pour ajuster le pH à 4,0. Les muropeptides ont été séparés par rpHPLC dans une colonne C18 (Hypersil GOLD aQ ; 250 × 4,6 mm ; 3 µm, Thermo Scientific) à un débit de 1 ml/min avec un gradient linéaire (0–20 %) appliqué entre 10 et 60 min (tampon A, TFA 0,1 % ; tampon B, acétonitrile 99,9 %, TFA 0,1 %, v/v). L'absorbance a été contrôlée à 205 nm et les fractions ont été recueillies, lyophilisées, remises en suspension dans de l'eau et analysées par spectrométrie de masse. Les spectres de masse ont été obtenus sur un spectromètre de masse haute résolution Bruker Daltonics maXis (Brême, Allemagne) fonctionnant en mode positif (Plateforme analytique du Muséum National d'Histoire Naturelle, Paris, France). Les données spectrales de masse ont été explorées à l'aide de mineXpert262.

BW25113 (ycbB, relA ') a été cultivé dans les conditions -CRO et + CRO dans des plaques de gélose BHI, comme pour la préparation de sacculi. Les bactéries ont été lysées avec du SDS à 4 % à 96 °C pendant 45 min. Les extraits bactériens bruts ont été séparés par SDS-PAGE. Lpp et RpoA (utilisés comme contrôle de chargement) ont été détectés avec des anticorps polyclonaux de lapin et de souris fournis par JF Collet et C. Beloin, respectivement. Les anticorps primaires ont été dilués au 1/10 000 (v/v). La détection a été effectuée avec des anticorps anti-lapin (Sigma) et anti-souris (Sigma) couplés à la peroxydase conformément aux instructions du fabricant du substrat de transfert Western PierceTM ECL (Thermo Scientific). Les anticorps secondaires ont été dilués au 1/2000 (v/v).

BW25113 (ycbB, relA ') a été cultivé à 37 ° C dans un bouillon BHI additionné d'IPTG 40 µM et de l-arabinose à 1% pour induire l'expression de ycbB et relA ', respectivement. À un OD600nm d'env. 0,25 ceftriaxone a été ajouté et l'incubation a été poursuivie pendant 2 h. Les bactéries (1 ml) ont été récoltées, lysées et la concentration de malondialdéhyde (MDA) a été déterminée conformément aux instructions du fabricant du kit de dosage Lipid Peroxidation MDA (Sigma).

Pour l'analyse Tn-seq, la reproductibilité est traitée par la corrélation des nombres de lecture moyens normalisés par CDS pour deux réplicats techniques séquencés obtenus pour les conditions -CRO et + CRO (Fig. 2a, b). Le traitement statistique des données Tn-seq est décrit sous la rubrique "Détermination de l'essentialité des gènes et du coût de fitness" dans la section "Méthodes". Les valeurs p ont été obtenues à partir de tests t bilatéraux non appariés. Pour les tests d'efficacité de placage, au moins deux répétitions biologiques ont été effectuées (les données en chiffres proviennent d'une expérience représentative). Pour l'analyse des peptidoglycanes par rpHPLC et spectrométrie de masse, trois répétitions biologiques indépendantes ont été réalisées (les données en chiffres proviennent d'une expérience représentative). Les données des tests de sensibilité aux antibiotiques sont des médianes de trois répétitions biologiques indépendantes. Pour l'analyse Western blot, les images sont un représentant de trois répétitions biologiques. Les concentrations de malondialdéhyde (MDA) sont la moyenne et l'écart type de trois répétitions biologiques. Les valeurs p ont été obtenues à partir de tests t bilatéraux non appariés.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données Tn-seq générées dans cette étude ont été déposées dans la base de données Sequence Read Archive (SRA) sous le code d'accession PRJNA907050. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Ce travail a été soutenu par l'ANR 'RegOPeps' (subvention ANR-19-CE44-0007 à JEH). HV est titulaire d'une bourse doctorale de Sorbonne-Université (ED 515, Complexité du Vivant). Nous remercions J. Lachuer et J. Bertrand de la plateforme génomique ProfileXpert/Viroscan3D pour le séquençage d'insertion de transposons. Nous remercions A. Marie pour son assistance technique dans la collecte des spectres de masse au Plateau Technique de Spectrométrie de Masse Bio-Organique du Muséum national d'Histoire Naturelle. Nous remercions JF Collet et C. Beloin pour le don généreux d'anticorps anti-Lpp et anti-RpoA, respectivement. Nous remercions Z. Edoo et F. Rusconi pour la lecture critique du manuscrit.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Michel Arthur, Jean-Emmanuel Hugonnet.

Centre de Recherche des Cordeliers, Sorbonne Université, Inserm, Université Paris Cité, F-75006, Paris, France

Henri Voedts, Guennadi Sezonov, Michel Arthur & Jean-Emmanuel Hugonnet

Institut Pasteur, Université Paris Cité, Département Biologie Computationnelle, F-75015, Paris, France

Sean P. Kennedy

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HV : conception et design, acquisition, analyse et interprétation des données, rédaction et révision de l'article. SK : analyse des données, rédaction et révision de l'article. GS : rédaction et révision de l'article. MA et JEH : conception et design, analyse et interprétation des données, rédaction et révision de l'article.

Correspondance à Michel Arthur ou Jean-Emmanuel Hugonnet.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Des rapports d'examen par les pairs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Voedts, H., Kennedy, SP, Sezonov, G. et al. L'identification à l'échelle du génome des gènes nécessaires à la réticulation alternative des peptidoglycanes chez Escherichia coli a révélé des impacts inattendus des β-lactamines. Nat Commun 13, 7962 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-35528-3

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Reçu : 11 août 2022

Accepté : 06 décembre 2022

Publié: 27 décembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-35528-3

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